Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против
5 июня 2012 г.
Текущий диагностических антимикробной чувствительности зависит от планктона роста изолятов в богатых питательными веществами, аэробных условиях. Здесь мы используем альтернативные искусственной среде мокроты для изучения антимикробной чувствительности синегнойной палочки биопленки при аэробных и микроаэрофильных условиях более представительным кистозный фиброз легких.
Целью данного эксперимента является оценка эффективности антибиотиков против биопленок Pseudomonas Aerogen в условиях, имитирующих хронические инфекции легких при муковисцидозе, с использованием определенной искусственной среды, имитирующей мокроту. Бактериальные биопленки выращивают в 24-луночных микротитрационных планшетах.
Затем биопленки подвергают воздействию антибиотиков. Далее культуры, обработанные антибиотиками, разрушают с помощью целлюлазы и инкубируют с метаболическим красителем срином, который восстанавливается жизнеспособными клетками из синего в розовый цвет. Измеряя оптическую плотность лунок, можно определить минимальную ингибирующую концентрацию для клеток биопленки (B-S-M-I-C), чтобы количественно оценить чувствительность к антибиотикам в условиях, близких к физиологическим.
Основное преимущество данной методики перед существующими методами, такими как определение минимальных подавляющих концентраций на основе планктонных культур, заключается в том, что бактерии выращиваются в специализированной среде, содержащей все компоненты мокроты, что способствует формированию биопленок. Такие биопленки обладают гораздо более высокой устойчивостью к антибиотикам. Для приготовления среды сначала подготовьте два флакона, наполнив первый 250 миллилитрами стерильной воды.
Постепенно перемешивая, добавьте 4 г ДНК спермы рыб в 250 мл стерильной воды. Перемешивайте раствор при комнатной температуре до полного растворения ДНК, затем перелейте во второй флакон. Постепенно добавьте 5 г муцина II типа из желудка свиньи и перемешайте.
После приготовления растворов ДНК и муцина растворите аминокислоты в 100 миллилитрах стерильной воды, за исключением L-тирозина и L-цистеина, которые следует растворить в 25 миллилитрах воды или 25 миллилитрах 0,5 молярного гидроксида калия соответственно. Затем растворите 5,9 миллиграмма DTPA, пять граммов хлорида натрия и 2,2 грамма хлорида калия в 100 миллилитрах воды. Смешайте все полученные растворы в бутылке объемом один литр, затем добавьте пять миллилитров эмульсии яичного желтка и доведите объем смеси водой до 850 миллилитров.
Используя 1 M раствор Трис, доведите pH до 6,9 и доведите конечный объем до 1 л водой. Чтобы стерилизовать среду, профильтруйте ее с помощью двухмембранного вакуумного насоса Vacuum Brand ME и фильтрующего модуля Millipore Stericup с диаметром горлышка 45 мм и размером пор 0,2 мкм. Процесс фильтрации может быть выполнен в течение двух дней. Среду A SM можно хранить при температуре 4 °C до одного месяца.
Начните с разведения ночных культур Pseudomonas aeruginosa в среде LB до достижения OD 0,05. Затем дополнительно разведите бактерии в соотношении 1:100 в среде SM; распределите по 1,8 мл разведенной бактериальной культуры в 21 лунку 24-луночного планшета для культивирования тканей. В три оставшиеся лунки внесите такой же объем среды SM, которые будут служить холостыми отрицательными контролями. Закройте 24-луночный планшет пленкой и, для формирования биопленок, поместите его в микроаэрофильные условия, которые можно создать с помощью газогенерирующих пакетов CampiGen в больших анаэробных камерах.
Инкубируйте культуру на шейкере при 75 RPM в течение трех дней при 37 °C. Через три дня биопленки появятся в виде гелеобразный массы, содержащей бактериальные клетки, которую невозможно разрушить путем пипетирования. После формирования биопленок добавьте в каждую лунку по 200 µL антибиотика в серийных разведениях. Обязательно подготовьте не менее четырех повторностей для каждой тестируемой концентрации препарата и оставьте четыре лунки с биопленками необработанными для использования в качестве отрицательного контроля.
Затем инкубируйте планшеты еще в течение 24 часов после инкубации с антибиотиками. Для разрушения биопленок используйте целлюлазу в концентрации 100 mg/mL в цитратном буфере, добавляя по 100 µL на лунку; инкубируйте планшеты на шейкере при 150 RPM в аэробных условиях при 37 °C в течение одного часа. После завершения данной инкубации можно использовать ручное дозирование пипеткой для дальнейшего расщепления биопленок, если в среде видны скопления клеток.
Затем добавьте по 100 µL резина в каждую лунку для количественного определения жизнеспособности клеток, высвобожденных из биопленок, и инкубируйте клетки в течение одного-двух часов. При температуре 37 °C только жизнеспособные клетки способны метаболизировать синий краситель зарин в его розовую флуоресцентную форму. После инкубации перенесите образцы в 96-луночный планшет и измерьте флуоресценцию в лунках, используя длину волны возбуждения 540 нм и длину волны испускания 590 нм.
Для количественного определения жизнеспособности бактерий и их чувствительности к препарату сначала вычтите фоновую флуоресценцию холостого контроля из значений остальных лунок. Затем рассчитайте процент ингибирования, разделив среднюю флуоресценцию для каждой концентрации на среднюю флуоресценцию необработанных контролей и умножив результат на 100. B-S-M-Y-C определяется как концентрация антибиотика, вызывающая 90% ингибирования метаболической активности; как показано на этих электронных микрофотографиях, клетки, выращенные в биопленках, значительно отличаются от бактерий, выращенных в планктонных культурах.
В частности, большое количество внеклеточного матрикса, показанное желтым цветом, окружает клетки в биопленке, отмеченной зеленым, но отсутствует в планктонных колониях. Кроме того, бактерии в биопленках в данном эксперименте обычно более устойчивы к антибиотикам. Минимальная ингибирующая концентрация тобрамицина для планктонной культуры Pseudomonas aerogenosa, отмеченной синим цветом, составила приблизительно 4 µg/mL.
Напротив, как показано красным цветом, 100% бактерий в биопленках выжили при концентрации антибиотика до 512 micrograms per milliliter. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как культивировать бактерии в определенной искусственной среде, имитирующей мокроту. Вы также должны уметь проводить тест на чувствительность к антибиотикам для определения минимальной подавляющей концентрации, необходимой для ингибирования роста бактерий в условиях, более приближенных к среде легких при муковисцидозе.
Обзор
В данном исследовании изучается чувствительность биопленок Pseudomonas aeruginosa к антибиотикам с использованием искусственной мокроты, имитирующей условия в легких при муковисцидозе. Работа подчеркивает различия в антибиотикорезистентности между биопленками и планктонными культурами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Антимикробная резистентность
- Исследование биопленок
Теоретические основы
- Современные методы тестирования чувствительности к антибиотикам сосредоточены на планктонных бактериях.
- Pseudomonas aeruginosa является распространенным патогеном у пациентов с муковисцидозом.
- Известно, что биопленки проявляют повышенную устойчивость к антибиотикам.
- Искусственная среда мокроты может лучше имитировать среду легких при муковисцидозе.
Цель исследования
- Оценить эффективность антибиотиков против биопленок Pseudomonas aeruginosa.
- Использовать определенную искусственную среду мокроты для создания более точных условий тестирования.
- Сравнить минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) антибиотиков в биопленках и в планктонных культурах.
Используемые методы
- Биопленки выращивали в 24-луночных микротитрационных планшетах в аэробных и микроаэрофильных условиях.
- На биопленки воздействовали антибиотиками, после чего проводили деструкцию с помощью целлюлазы.
- Жизнеспособность клеток оценивали с использованием метаболического красителя, который выявляет живые клетки.
- Для определения чувствительности к антибиотикам проводили измерения флуоресценции.
Основные результаты
- Биопленки продемонстрировали значительно более высокую устойчивость к антибиотикам по сравнению с планктонными культурами.
- Минимальная подавляющая концентрация тобрамицина была намного выше в биопленках.
- В биопленках было отмечено наличие внеклеточного матрикса, что способствовало развитию резистентности.
- Данное исследование предлагает надежный метод тестирования эффективности антибиотиков в условиях биопленки.
Выводы
- Искусственная среда мокроты эффективна для изучения чувствительности биопленок к антибиотикам.
- Биопленки создают особые трудности при лечении хронических инфекций при муковисцидозе.
- Будущие исследования должны быть сосредоточены на преодолении связанной с биопленками антибиотикорезистентности.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Современное тестирование чувствительности к противомикробным препаратам часто не позволяет предсказать клинические результаты при муковисцидозе из-за расхождений между стандартными анализами планктонных форм и микроаэрофильными условиями хронических легочных инфекций, при которых микроорганизмы находятся в биопленках. Этот пробел повышает риск продвижения неэффективных антибиотиков на этапе доклинической разработки, что приводит к дорогостоящим неудачам на поздних стадиях. Внедряя искусственную среду мокроты и модели биопленок при физиологически значимых уровнях кислорода, группы исследований и разработок могут улучшить валидацию мишеней и снизить риски при выборе ведущих соединений за счет более прогностического скрининга эффективности.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать эффективность антибиотиков против P. aeruginosa, встроенных в биопленку, в условиях, имитирующих легкие при муковисцидозе, что способствует валидации мишеней в моделях персистирующей инфекции.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимый формат с использованием микротитрационных планшетов для высокопроизводительной оценки минимальной ингибирующей концентрации (МИК) для сессильных клеток (SMIC) для нескольких изолятов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные результаты на основе флуоресценции для измерения разрушения биопленок и ингибирования метаболизма, что делает возможным анализ зависимости «доза-эффект» в условиях, приближенных к физиологическим.
- Практическая ценность: использование стандартизированных реагентов (резазурина, целлюлазы) и определенной искусственной среды мокроты обеспечивает согласованность анализа и снижает вариабельность при определении профиля чувствительности к антибиотикам.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: фиксирует повышенную устойчивость к антибиотикам в биопленках — SMIC для тобрамицина в микроаэрофильных условиях может быть более чем в 128 раз выше, что указывает на ограниченность пороговых значений MIC для планктонных форм.
- Практическая ценность: помогает в выборе доклинических моделей путем идентификации соединений, сохраняющих активность против патогенов, встроенных в биопленку, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) в программах по созданию противоинфекционных препаратов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Анализ биопленки ASM вписывается в континуум поиска антибактериальных средств, особенно на этапе после первичной идентификации хитов и перед оптимизацией соединений-лидеров, когда понимание взаимодействия с мишенью в сложных физиологических средах помогает в определении приоритетов.
- Фундаментальная биология: Проверка гипотезы о значительном снижении эффективности антибиотиков в состояниях биопленки и микроаэрофилии, что позволяет уточнить уязвимость мишеней в нишах хронической инфекции.
- Скрининг: Получение воспроизводимых количественных данных SMIC, позволяющих сравнивать активность антибиотиков для различных изолятов и условий, что способствует стандартизации анализа.
- Аналитика: Построение кривых ингибирования и определение значений SMIC, которые позволяют проводить сравнительный анализ условий и статистическую оценку сдвигов чувствительности к антибиотикам.
- Трансляционные исследования: Связь результатов in vitro с патофизиологией муковисцидоза путем моделирования роста биопленок и парциального давления кислорода, наблюдаемых в мокроте пациентов.
- Прикладное использование: Создание универсальной платформы для оценки различных классов антибиотиков против патогенов, образующих биопленки, что сокращает затраты на повторную разработку методов анализа.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов, выявляя механизмы резистентности, зависящие от условий, которые не определяются при стандартных тестах на чувствительность.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость за счет четко определенного состава среды, стандартизированного времени формирования биопленки и автоматизированного считывания флуоресценции.
- Стратегическая ценность: Снижает неопределенность при оценке биологических рисков в разработке противоинфекционных препаратов путем идентификации соединений, которые с высокой вероятностью окажутся неэффективными в моделях инфекций с наличием биопленок.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию перспективных соединений с учетом рисков на основе их эффективности в физиологически релевантных моделях инфекций, что оптимизирует распределение капитала.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области микробиологии, культивирования биопленок, а также методы анаэробного и микроаэрофильного культивирования.
- Необходим доступ к микрофлюидному оборудованию или флуоресцентному плейт-ридеру, способному детектировать резазурин (Ex/Em ~540/590 nm).
- Требуется стандартизация протоколов разрушения биопленок (например, обработка целлюлазой) между исследовательскими группами для обеспечения согласованности данных о жизнеспособности.
- При распространении данной модели на другие патогены или классы антибиотиков, помимо тобрамицина и P. aeruginosa, необходимо учитывать особенности адаптации метода.
- Практические ограничения включают 3-дневный период формирования биопленки и необходимость строгого контроля содержания кислорода для поддержания микроаэрофильных условий, что может увеличить продолжительность и сложность анализа.
