Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против Синегнойной палочки В условиях более актуальными для кистозного фиброза легких

Целью данного эксперимента является оценка эффективности антибиотиков в отношении биопленок Pseudomonas Aerogen в условиях, характерных для хронических инфекций легкого с муковисцидозом с использованием определенной искусственной среды мокроты. Бактериальные биопленки выращивают в 24. Хорошо микротитровальные пластины.

Затем биопленки подвергаются воздействию антибиотиков. Затем культуры, обработанные антибиотиками, разрушаются с помощью целлюлазы и инкубируются с метаболическим красителем srin, который восстанавливается от синего до розового жизнеспособными клетками. Измеряя абсорбцию лунок, можно определить минимальную ингибиторную концентрацию B-S-M-I-C в биопленочных клетках Сесиль для количественной оценки чувствительности к антибиотикам в условиях, близких к физиологическим.

Основное преимущество данной методики перед существующими методами, такими как определение минимальных ингибиторных концентраций на основе планктонной культуры, заключается в том, что бактерии выращиваются в специализированной среде, содержащей все компоненты мокроты, тем самым способствуя образованию биопленки. Эти биопленки гораздо более устойчивы к антибиотикам. Для приготовления средства сначала готовят две бутылки, содержащие в первой бутылке 250 миллилитров стерильной воды.

Постепенно добавляйте перемешивание, а затем добавьте четыре грамма спермы рыбы, ДНК на 250 миллилитров стерильной воды. Размешайте раствор при комнатной температуре и дайте ДНК раствориться во втором флаконе. Постепенно добавьте пять граммов муцина второго типа из свиного желудка и перемешайте.

Как только растворы ДНК и муцина будут готовы, растворите аминокислоты в 100 миллилитрах стерильной воды, за исключением L-тирозина и L-цистеина, которые следует растворить в 25 миллилитрах воды, или 25 миллилитрах 0,5 молярного гидроксида калия соответственно. Далее на 100 миллилитров воды получается 5,9 миллиграмма DTPA, пять граммов хлорида натрия и 2,2 грамма хлорида калия. Соедините все различные растворы в литровой бутылке, затем добавьте пять миллилитров эмульсии яичного желтка и долейте смесь до 850 миллилитров воды.

С помощью одного моляра трисса отрегулировать pH до 6,9 и довести итоговый объем до одного литра с водой для стерилизации среды, отфильтровать ее с помощью вакуумного вакуумного насоса марки ME с двумя диафрагмами, а также стерео верхнего фильтрующего блока Millipore с горловиной 45 миллиметров и размером пор 0,2 мкм. Процесс фильтрации может быть выполнен в течение двух дней. Среда A SM может храниться при температуре четыре градуса Цельсия до одного месяца.

Начните с разведения в течение ночи культур pseudomona arosa в среде LB до получения OD 0,05. Затем дополнительно разбавляют бактерии в соотношении от одного до 100 в средней чашке SM, по 1,8 миллилитров на лунку разбавленной бактериальной культуры в 21 лунке из 24-луночной тарелки для культивирования тканей и в том же объеме среды SM в трех оставшихся лунках, которые будут служить в качестве пустого отрицательного контроля. Закрепите 24-луночный планшет биопленкой, а чтобы обеспечить образование биопленки, поместите его в условия микропогрешности, которые можно получить с помощью газогенерирующих пакетов campi gen в больших анаэробных банках.

Инкубируйте культуру в шейкере, настроенном на 75 об/мин, в течение трех дней при 37 градусах Цельсия, через три дня биопленки будут выглядеть как студенистая масса, содержащая бактериальные клетки, и не могут быть разрушены пипетированием. После этого образуются биопленки по 200 микролитров на лунку антибиотика в серийно разбавленных концентрациях. Обязательно установите не менее четырех повторов для каждой концентрации тестируемого препарата и оставьте четыре лунки, содержащие биопленки, необработанными, чтобы их можно было использовать в качестве отрицательного контроля.

Затем предварительно инкубируйте пластины в течение следующих 24 часов после инкубации с антибиотиками. Используйте 100 микролитров на лунку целлюлазы, разведенной до 100 мг на миллилитр в цитратном буфере для разрушения биопленок, инкубируйте планшеты на шейкере, установленном на 150 об/мин, в аэробных условиях при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. В соответствии с настоящим руководством по инкубации можно использовать пипетирование для дальнейшей дезагрегации биопленок, если в среде видны скопления клеток.

Затем добавьте 100 микролитров резина в лунку, чтобы количественно оценить жизнеспособность клеток, высвобождаемых из биопленок, и инкубируйте клетки в течение одного-двух часов. При температуре 37 градусов Цельсия только жизнеспособные клетки способны метаболизировать синий краситель зарин до его розовой флуоресцентной формы. После инкубации перенесите образцы в планшет с 96 лунками и измерьте флуоресценцию лунок с использованием пяти волн возбуждения 40 нм и пяти длин волны излучения 90 нм.

Чтобы количественно оценить жизнеспособность бактерий и чувствительность к лекарственным препаратам, сначала вычтите фоновую флуоресценцию контрольной болванки из других лунок. Затем рассчитайте процент ингибирования, разделив среднюю флуоресценцию для каждой концентрации на среднюю флуоресценцию необработанного контроля и умножив на 100. B-S-M-Y-C определяется как концентрация антибиотика, вызывающая 90%-ное ингибирование метаболической активности, как показано на этих электронных микрофотографиях: клетки, выращенные в биопленках, значительно отличаются от бактерий, выращенных в планктонных культурах.

В частности, большое количество внеклеточного матрикса, показанного желтым цветом, окружает клетки в биопленке зеленым цветом, но не в планктонных колониях. Кроме того, бактерии в биопленках, как правило, более устойчивы к антибиотикам в этом эксперименте. Минимальная ингибирующая концентрация тобрамицина для планктонной культуры pseudomonas aerogen в синем цвете составила примерно четыре микрограмма на миллилитр.

Напротив, как показано красным цветом, 100% бактерий в биопленках выживают до 512 микрограммов на миллилитр антибиотика. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как культивировать бактерии в определенной искусственной среде мокроты. Вы также должны быть в состоянии провести тест на чувствительность к антибиотикам, чтобы определить минимальную ингибиторную концентрацию, необходимую для подавления роста бактерий в среде, более реалистичной при муковисцидозе легких.