Использование искусственного среднего мокроты для тестирования антибиотиков эффективность против

Целью данного эксперимента является оценка эффективности антибиотиков против биопленок Pseudomonas Aerogen в условиях, имитирующих хронические инфекции легких при муковисцидозе, с использованием определенной искусственной среды, имитирующей мокроту. Бактериальные биопленки выращивают в 24-луночных микротитрационных планшетах.

Затем биопленки подвергают воздействию антибиотиков. Далее культуры, обработанные антибиотиками, разрушают с помощью целлюлазы и инкубируют с метаболическим красителем срином, который восстанавливается жизнеспособными клетками из синего в розовый цвет. Измеряя оптическую плотность лунок, можно определить минимальную ингибирующую концентрацию для клеток биопленки (B-S-M-I-C), чтобы количественно оценить чувствительность к антибиотикам в условиях, близких к физиологическим.

Основное преимущество данной методики перед существующими методами, такими как определение минимальных подавляющих концентраций на основе планктонных культур, заключается в том, что бактерии выращиваются в специализированной среде, содержащей все компоненты мокроты, что способствует формированию биопленок. Такие биопленки обладают гораздо более высокой устойчивостью к антибиотикам. Для приготовления среды сначала подготовьте два флакона, наполнив первый 250 миллилитрами стерильной воды.

Постепенно перемешивая, добавьте 4 г ДНК спермы рыб в 250 мл стерильной воды. Перемешивайте раствор при комнатной температуре до полного растворения ДНК, затем перелейте во второй флакон. Постепенно добавьте 5 г муцина II типа из желудка свиньи и перемешайте.

После приготовления растворов ДНК и муцина растворите аминокислоты в 100 миллилитрах стерильной воды, за исключением L-тирозина и L-цистеина, которые следует растворить в 25 миллилитрах воды или 25 миллилитрах 0,5 молярного гидроксида калия соответственно. Затем растворите 5,9 миллиграмма DTPA, пять граммов хлорида натрия и 2,2 грамма хлорида калия в 100 миллилитрах воды. Смешайте все полученные растворы в бутылке объемом один литр, затем добавьте пять миллилитров эмульсии яичного желтка и доведите объем смеси водой до 850 миллилитров.

Используя 1 M раствор Трис, доведите pH до 6,9 и доведите конечный объем до 1 л водой. Чтобы стерилизовать среду, профильтруйте ее с помощью двухмембранного вакуумного насоса Vacuum Brand ME и фильтрующего модуля Millipore Stericup с диаметром горлышка 45 мм и размером пор 0,2 мкм. Процесс фильтрации может быть выполнен в течение двух дней. Среду A SM можно хранить при температуре 4 °C до одного месяца.

Начните с разведения ночных культур Pseudomonas aeruginosa в среде LB до достижения OD 0,05. Затем дополнительно разведите бактерии в соотношении 1:100 в среде SM; распределите по 1,8 мл разведенной бактериальной культуры в 21 лунку 24-луночного планшета для культивирования тканей. В три оставшиеся лунки внесите такой же объем среды SM, которые будут служить холостыми отрицательными контролями. Закройте 24-луночный планшет пленкой и, для формирования биопленок, поместите его в микроаэрофильные условия, которые можно создать с помощью газогенерирующих пакетов CampiGen в больших анаэробных камерах.

Инкубируйте культуру на шейкере при 75 RPM в течение трех дней при 37 °C. Через три дня биопленки появятся в виде гелеобразный массы, содержащей бактериальные клетки, которую невозможно разрушить путем пипетирования. После формирования биопленок добавьте в каждую лунку по 200 µL антибиотика в серийных разведениях. Обязательно подготовьте не менее четырех повторностей для каждой тестируемой концентрации препарата и оставьте четыре лунки с биопленками необработанными для использования в качестве отрицательного контроля.

Затем инкубируйте планшеты еще в течение 24 часов после инкубации с антибиотиками. Для разрушения биопленок используйте целлюлазу в концентрации 100 mg/mL в цитратном буфере, добавляя по 100 µL на лунку; инкубируйте планшеты на шейкере при 150 RPM в аэробных условиях при 37 °C в течение одного часа. После завершения данной инкубации можно использовать ручное дозирование пипеткой для дальнейшего расщепления биопленок, если в среде видны скопления клеток.

Затем добавьте по 100 µL резина в каждую лунку для количественного определения жизнеспособности клеток, высвобожденных из биопленок, и инкубируйте клетки в течение одного-двух часов. При температуре 37 °C только жизнеспособные клетки способны метаболизировать синий краситель зарин в его розовую флуоресцентную форму. После инкубации перенесите образцы в 96-луночный планшет и измерьте флуоресценцию в лунках, используя длину волны возбуждения 540 нм и длину волны испускания 590 нм.

Для количественного определения жизнеспособности бактерий и их чувствительности к препарату сначала вычтите фоновую флуоресценцию холостого контроля из значений остальных лунок. Затем рассчитайте процент ингибирования, разделив среднюю флуоресценцию для каждой концентрации на среднюю флуоресценцию необработанных контролей и умножив результат на 100. B-S-M-Y-C определяется как концентрация антибиотика, вызывающая 90% ингибирования метаболической активности; как показано на этих электронных микрофотографиях, клетки, выращенные в биопленках, значительно отличаются от бактерий, выращенных в планктонных культурах.

В частности, большое количество внеклеточного матрикса, показанное желтым цветом, окружает клетки в биопленке, отмеченной зеленым, но отсутствует в планктонных колониях. Кроме того, бактерии в биопленках в данном эксперименте обычно более устойчивы к антибиотикам. Минимальная ингибирующая концентрация тобрамицина для планктонной культуры Pseudomonas aerogenosa, отмеченной синим цветом, составила приблизительно 4 µg/mL.

Напротив, как показано красным цветом, 100% бактерий в биопленках выжили при концентрации антибиотика до 512 micrograms per milliliter. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как культивировать бактерии в определенной искусственной среде, имитирующей мокроту. Вы также должны уметь проводить тест на чувствительность к антибиотикам для определения минимальной подавляющей концентрации, необходимой для ингибирования роста бактерий в условиях, более приближенных к среде легких при муковисцидозе.