Одоранта вызванных ответов Записано от обонятельных нейронов рецептора с помощью техники Всасывание пипеткой

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы зарегистрировать индуцированные запахом реакции нейронов обонятельных рецепторов мыши. Это достигается путем рассечения обонятельного эпителия и изоляции нейронов обонятельных рецепторов мыши. Второй шаг заключается в помещении изолированных нейронов обонятельных рецепторов в записывающую камеру, установленную на перевернутом микроскопе.

Микроманипуляторы удерживают записывающий электрод и устройство смены раствора. Затем всосите идентифицированный нейрон обонятельного рецептора в кончик всасывающего электрода пипетки. Последний шаг заключается в том, чтобы поместить пипетку с всасываемой клеткой на кончике перед устройством изменения раствора, чтобы подвергнуть нейрон воздействию пахучих веществ.

В конечном счете, метод записи с помощью аспирационной пипетки используется для исследования функции нейронов обонятельных рецепторов. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как метод клещей напряжения всей ячейки, заключается в том, что он позволяет проводить длительную запись с использованием быстрых и точных изменений раствора. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как форма записывающей пипетки имеет большое значение, а стабильное размещение гнездовых ячеек на кончике пипетки является трудным для изучения.

Начните эту процедуру с вытягивания микропипетки с капилляром из силикатного стекла UNFI в микропипетке с длинным конусом. Затем переложите пипетку в специально изготовленный держатель микропипетки, установленный на вертикальном микроскопе. Микроскоп имеет редл в окуляре и подвижный алмазный нож, установленный на сцене.

Затем обратите внимание на кончик пипетки под объективом 20x. Используйте редл в качестве ориентира. Аккуратно нанесите на пипетку угол 90 градусов с помощью изготовленного на заказ алмазного ножа с внешним диаметром пипетки 10 микрометров.

Переместите алмазный нож дальше к кончику. Постепенно надавливайте на него. Наконечник пипетки должен быть аккуратно сломан в том месте, где он был написан.

Затем под действием объектива 40 x отполируйте кончик пипетки до внутреннего диаметра пяти микрометров с помощью нити с электрическим нагревом. После этого микропипетка готова к использованию для регистрации токов от мыши. На следующем шаге пожертвуйте мышь и удалите ее голову.

Затем снимите кожу над черепом, впоследствии рассеките голову пополам по средней линии. Затем перенесите две головки Hemi в препарирующий стереомикроскоп. Оттяните носовую перегородку и удалите обонятельные носовые раковины.

Поместите ткань в чашку Петри с глюкозосодержащим раствором млекопитающих. После этого отделите обонятельный эпителий от подлежащего хряща от двух носовых раковин. Переложите ткань в эйнорскую трубку, содержащую 250 микролитров рингера.

Затем храните оставшуюся ткань при температуре четыре градуса Цельсия на потом. Используйте вихревую трубку для повышения нефтеотдачи пласта, содержащую обонятельный эпителий, дважды кратковременно в течение одной секунды со средней скоростью. Этот этап приводит к механической диссоциации NS от эпителия.

Затем поместите раствор Рингера, содержащий диссоциированные орны, в записывающую камеру, установленную на микроскопе, удалите крупные кусочки ткани в суспензии с помощью пары тонких щипцов. Дайте ОРН отстояться в течение 20 минут, прежде чем начать непрерывную перфузию раствором Рингера и, приступая к записи в этой процедуре, заполните пипетку раствором Рингера. Поместите пипетку в держатель пипетки и прикрепите держатель к головному столику усилителя патч-зажима.

Далее подсоедините масляную магистраль к боковому порту держателя пипетки. Затем опустите пипетку в камеру записи. Отрегулируйте высоту масляного резервуара, чтобы создать слегка положительное давление на кончике пипетки.

Это можно сделать, наблюдая за тем, как клеточный мусор удаляется от пипетки или движется к ней. Старайтесь не загрязнять кончик пипетки клеточным мусором. Затем просканируйте записывающую камеру на наличие изолированного ORN, который можно распознать по его типичной биполярной морфологии с использованием увеличения от 20 до 40 раз.

Затем переместите записывающий электрод в непосредственной близости от корпуса ячейки ORN. Аккуратно всасывайте воздухопровод, соединенный с масляным резервуаром, так, чтобы тело клетки вошло в кончик пипетки. Продолжайте применять отсасывание осторожно и медленно, пока все тело клетки не будет втянуто в кончик отсасывающей пипетки, оставляя дендрит и реснички открытыми для ванны.

Переместите аспирационную пипетку из секции, содержащей отстоявшиеся орны, в секцию записи камеры. Осторожно поместите отсасывающий пипетку перед трехцилиндрической трубкой для обмена раствором. Всасывающий пипетка должен быть расположен достаточно близко к отверстию трехцилиндрической трубки, чтобы ORN подвергался воздействию ламинарного потока и, таким образом, предотвращал турбулентность смешивания.

Можно измерить ток перехода, возникающий при перемещении ячейки между растворами различного ионного состава. Время обмена решениями обычно составляет около 20 миллисекунд. Когда нейрон обонятельного рецептора вводится в раствор одоранта, здесь может быть вызвана вызванная одорантом реакция.

ORN подвергался воздействию эвгенола в сотню микромоляров в течение одной секунды, как указано на полосе над записью. В верхней панели ток рецептора фильтруется в полосе пропускания от нуля до 50 герц для отображения тока рецептора Только нижняя панель показывает ту же запись, отфильтрованную в широкой полосе от нуля до 5000 герц, чтобы также отображать потенциалы действия. Ниже приведены дозовые реакции эвгенол-чувствительного ОРН: эвгенол использовался в концентрациях от 0,3 микромоляра до ста микромоляров.

Длительность стимула составляла одну секунду, а следы фильтровались с частотой от нуля до 50 Гц. Прогрессирующее увеличение концентрации одоранта приводило к более сильному и быстрому нарастающему отклику, который также заканчивался медленнее. После прекращения воздействия одоранта ORNS может проявлять колебательную реакцию во время длительной стимуляции при средних концентрациях одоранта.

В этом случае ацетофенон-чувствительный ORN стимулировался в течение восьми секунд после быстрого и преходящего пикового ответа в начале стимуляции. При попытке выполнить эту процедуру наблюдается ряд более мелких повторяющихся реакций. Важно помнить, что с нейронами обонятельных рецепторов нужно обращаться осторожно и быть очень терпеливым.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.