Обнаружение микроРНК в опухолях простаты количественного ПЦР в реальном времени (КПЦР)

Общая цель данного эксперимента заключается в количественном определении уровней экспрессии молекул микроРНК в тканях рака предстательной железы и нормальной ткани предстательной железы с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для этого сначала проводят экстракцию тотальной РНК из тканей предстательной железы, которая включает мРНК, микроРНК и другие малые РНК.

Затем РНК подвергается обратной транскрипции для получения кДНК. Далее проводится ПЦР в реальном времени с использованием красителя Cyber Green, где кДНК служит матрицей для амплификации и количественного определения экспрессии микроРНК в режиме реального времени. В результате количественной ПЦР в реальном времени определяются уровни относительной экспрессии микроРНК в различных образцах тканей предстательной железы.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с другими подходами является его высокая чувствительность, точность, воспроизводимость, а также быстрота и экономическая эффективность. Этот метод может быть использован для поиска ответов на ключевые вопросы в области биологии рака, поскольку экспрессия микроРНК часто коррелирует с генами, которые в значительной степени вовлечены в онкогенез. Таким образом, мы можем использовать QPCR для оценки экспрессии микроРНК и анализа её корреляции с клиническими переменными.

Эти биомаркеры потенциально могут быть использованы как диагностические, так и прогностические инструменты. Они могут помочь в диагностике рака предстательной железы, а также в определении степени агрессивности конкретных форм этого заболевания. Кроме того, данные биомаркеры могут обладать потенциалом в качестве терапевтических агентов.

Данный метод не только позволяет получить представление о генезе опухолей предстательной железы, но и может быть применен при других видах рака и заболеваниях. Соберите образцы предстательной железы во время эктомии и ориентируйте образец с помощью анатомических ориентиров. Окрасьте предстательную железу и семенные пузырьки следующим образом: правую сторону — зеленым, левую сторону — синим цветом.

Сделайте случайный поперечный срез ткани перпендикулярно поверхности прямой кишки, заморозьте образец и храните его при температуре -80 °C. Сделайте фотографию, сориентируйте срезы образцов и разделите их на четыре равные части. Проконсультируйтесь с патологоанатомом, чтобы определить области опухоли и нормальные ткани на соответствующем изображении.

Используйте отмеченные области в качестве ориентира для идентификации опухолевой ткани с целью экстракции РНК для последующего выделения РНК. Начните с размещения замороженных образцов предстательной железы на сухом льду, сверяясь с соответствующей фотокопией. Вырежьте небольшую часть опухоли предстательной железы.

Гомогенизируйте ткань опухоли предстательной железы в одном миллилитре реагента триол. Инкубируйте гомогенизаты в течение пяти минут. При комнатной температуре добавьте в образцы 0.2 миллилитра хлороформа и интенсивно встряхивайте в течение 15 секунд.

Инкубируйте образцы в течение трех минут при комнатной температуре, затем центрифугируйте при 12 000 ×g в течение 15 минут при температуре 4 °C. Перенесите бесцветную верхнюю водную фазу в новые пробирки и добавьте 0,5 мл изопропилового спирта. Инкубируйте образцы в течение 10 минут при комнатной температуре, затем центрифугируйте при 12 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C.

Осторожно аспирируйте супернатант, чтобы не потревожить осадок, содержащий РНК. Добавьте один миллилитр 75% этанола к осадку РНК, перемешайте образец на вортексе и осадите путем центрифугирования в течение пяти минут при 7 500 ×g и температуре четыре градуса Цельсия. Снова аспирируйте супернатант и высушите осадок РНК в течение от пяти до 10 минут, следя за тем, чтобы он не пересох полностью.

Растворите осадок в воде, свободной от нуклеаз, и с помощью спектрофотометра измерьте концентрацию РНК. Используйте биоанализатор для проверки качества и целостности образцов РНК. Проведите обратную транскрипцию РНК в кДНК с использованием набора для обратной транскрипции в соответствии с инструкциями производителя.

Для построения стандартной кривой подготовьте серию разведений исходного CD NA из образца с заведомо высоким уровнем экспрессии исследуемого гена. Проведите ПЦР в реальном времени, подготовив мастер-микс исходя из объема реакции 20 µL, состоящий из 2x quant. Detect cyber green PCR master mix, 10x microscript universal primer, 10x microscript primer assay и RN a's free water.

Добавьте два набора праймеров: один для целевого гена, а другой для референсного гена, в данном случае RNU6B. Пипетируйте по 2 µL каждого разведения кДНК в отдельные капиллярные пробирки для амплификатора в реальном времени и добавьте 18 µL мастер-микса. Центрифугируйте пробирки с использованием адаптера для капилляров. Поместите капилляры в амплификатор в реальном времени на базе капиллярных пробирок и запустите программу ПЦР следующим образом: 95 °C в течение 15 минут, затем 50 циклов: 94 °C в течение 15 секунд.

55 °C в течение 30 секунд и 70 °C в течение 30 секунд. Выберите образец в качестве калибратора и установите его нормализованное целевое количество равным единице. Сравните относительную экспрессию микроРНК во всех остальных образцах с калибратором для построения кривых амплификации.

Для проведения ПЦР-реакций используйте программное обеспечение Molecular Biochemicals LightCycler версии 3.5 на вкладке quantification. Проведите количественный анализ реакций и экспортируйте данные в текстовый файл. Импортируйте данные в программное обеспечение REL quant analysis для получения результатов количественного анализа.

Импортируйте отдельные файлы с данными для целевого гена, референсного гена и стандартной кривой. Укажите положение калибратора как для целевого, так и для референсного гена, а также положение образцов. Данные выражаются как отношение целевого гена к референсному для различных образцов, деленное на отношение целевого гена к референсному для калибратора.

Используйте стандартную кривую, ранее построенную для конкретной микроРНК и генного контроля, в качестве эталона для экстраполяции количественных данных о микроРНК с неизвестной концентрацией. Проанализируйте три образца в одной группе, рассчитайте средние концентрации и стандартные отклонения для этих трех повторностей.

Если один из трех повторов оказывается несогласованным с остальными образцами в наборе, программа исключает его. Здесь представлен пример анализа A-Q-P-C-R образцов предстательной железы. Графики, отображающие уровни экспрессии референсного гена U six, демонстрируют начало экспоненциального усиления примерно на 20-м цикле, тогда как экспрессия целевого гена MIR 98 показала задержанное усиление около 25-го цикла.

Данные этого эксперимента были экспортированы в виде текстового файла и проанализированы с помощью программного обеспечения для анализа; при этом указываются положения капилляров, содержащих калибратор и образцы. При наличии соответствующего опыта данная процедура может быть выполнена за один день при правильном подходе. Надежность этого метода зависит от качества РНК.

Поэтому при работе с РНК необходимо соблюдать особую осторожность, так как она очень легко деградирует.