Алчность на основе взаимодействия внеклеточной скрининга (AVEXIS) для масштабируемых обнаружения низкого сродства внеклеточного рецептор-лиганд

Общая цель этой процедуры заключается в обнаружении новых внеклеточных белковых взаимодействий, участвующих в процессах клеточного узнавания, в частности, мембранных рецепторных белков. Подход AveXis разработан для того, чтобы обойти очень слабое сродство взаимодействия, которое типично для этого класса белковых взаимодействий, и тот факт, что мембранные белки трудно поддаются биохимическому манипулированию. Это достигается путем предварительной компиляции библиотеки рекомбинантных белков внеклеточных областей рецепторов клеточной поверхности.

Это достигается за счет конструирования экспрессирующих плазмид для производства эктодоменных областей рецепторов в виде растворимых фрагментов как в виде мономерных биотинилированных приманок, так и в виде пентамеров, меченных ферментом. Второй шаг заключается в экспрессии и нормализации белков, чтобы быть готовыми к скринингу взаимодействия. Все белки производятся в клетках млекопитающих, чтобы обеспечить добавление посттрансляционных модификаций, таких как дисс, сульфид, связи и гликозилирование.

Важным шагом в протоколе является обеспечение того, чтобы все белки приманки и добычи в библиотеке нормализовались в пределах пороговых уровней. Далее следует захватывающая часть — отбор новых взаимодействий. Реакторы Бейтса помещаются в отдельные лунки микротной пластины, а затем исследуются на предмет взаимодействий с помощью похвалы.

Затем выполняется этап промывки. Последним шагом является добавление субстрата для фермента, чтобы обнаружить любую захваченную похвалу на массивах белков-приманок. В конечном счете, результаты скрининга VEX могут показать, рецепторы каких клеток способны образовывать партнеров по связыванию и, следовательно, могут быть вовлечены в процессы распознавания и коммуникации между клетками.

Основным преимуществом данной методики популярных методов экстракции белка, таких как двухдрожжевая гибридная или биохимическая очистка, является то, что она специально разработана для выявления внеклеточных белковых взаимодействий. Он особенно подходит для открытия новых взаимодействий между мембранными привязанными рецепторными белками. Эти взаимодействия трудно обнаружить с помощью других методов, потому что мембранные белки биохимически трудно манипулировать, а типичные их взаимодействия с рецепторами чрезвычайно слабы.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с тем, как клетки распознают и общаются друг с другом. На молекулярном уровне он может быть использован для ответа на вопросы, относящиеся к основным биологическим процессам, таким как какие рецепторные белки, отображаемые на поверхности яйцеклеток и сперматозоидов, объединились друг с другом, или какие взаимодействия рецепторных лигандов отвечают за клеточное поведение, такое как слияние миоцитов или формирование нервного гребня. Основная сложность этого подхода заключается в том, чтобы собрать библиотеки белков для приманки и молитвы, в которых можно проводить скрининг взаимодействий.

Также очень важно убедиться, что белки приманки и добычи нормализованы в пределах пороговых уровней, необходимых для проведения анализа. Это сокращает частоту ложноотрицательных и ложноположительных результатов. Впервые идея этого метода пришла мне в голову во время работы над докторской диссертацией, когда я пытался определить партнера по связыванию белка клеточной поверхности CD 200.

По сути, я задавал вопрос, какова схема связывания для этого конкретного рецептора клеточной поверхности? Даже сегодня? В то время на этот вопрос было технически трудно ответить, однако геном человека был близок к завершению, и я понял, что, поскольку теперь у нас есть полный список всех рецепторов клеточной поверхности в геноме, мы можем вместо этого спросить о том, какие рецепторные белки могут взаимодействовать технически.

На этот вопрос гораздо проще ответить, и AveXis был методом, который мы разработали для ответа на него. После того, как создана библиотека приманок и векторов предварительной экспрессии, подготовьтесь к их трансфекции в клетки HEC 2 9 3 E Начните с посева клеток за день до трансфекции с плотностью 250 000 клеток на миллилитр в 50 миллилитров среды freestyle 2 9 3 для обеспечения эффективного выделения биотина. Дополняйте среду, используемую для производства белков-приманок, не добычу белков с d биотином со всеми подготовленными пластинами, инкубируйте клетки в течение ночи в стандартных условиях.

Поскольку биотин обладает низкой растворимостью и точным раствором, мы предпочитаем взвесить дополнительный биотин, а затем добавить его в среду и энергично встряхнуть на следующий день. Трансфектируйте 50 миллилитров культивируемых клеток с 25 микрограммами приманки или плазмиды добычи, используя подходящий реагент для трансфекции для получения биотинилированных приманок. Приманка конструируется в соотношении 10 к одному с плазмидами, кодирующими секретируемую форму белка ELI биотинлигазы за один урожай.

Культуры через пять дней после трансфекции сначала опускают клетки центрифугированием при 3000-кратной гравитации в течение 20 минут, а затем фильтруют S-надосадочную жидкость через фильтр 0,22 микрона. Одной из ключевых особенностей AveXis является то, что рекомбинантные белки секретируются, их можно разбавлять или концентрировать до пороговых значений активности. Мы обнаружили, что рекомбинантные белки имеют вариабельную экспрессию до четырех порядков величины, поэтому этап нормализации снижает частоту ложноположительных результатов на этапах скрининга.

Чтобы начать нормализацию приманки, неконъюгированный дебиотин должен быть удален из среды с помощью диализа, так как он будет конкурировать за биотинилированный белок приманки за связывание со стриптом в местах связывания. Мы обнаружили, что для обеспечения эффективного диализа рекомбинантных белков важно обеспечить избыточную площадь поверхности диализной трубки. Как правило, мы предоставляем в два-три раза больше трубок, чем фактически требуется для диализуемого объема.

В течение 24 часов приманка подвергается интенсивному диализу в сравнении с подходящим буфером, таким как PBS, после проведения диализа. ELIZA начинается с блокирования лунок микрот-планшета, кодированного стрептококком, PBST, содержащим BSA, на 15 минут. Тем временем на чистой тарелке сделайте серию из четырех одно-трех разбавлений белков приманки в PBST с 2% BSA.

После 15-минутной инкубации переложите разведенный раствор на стрептококковую пластину с кодировкой TTR и инкубируйте пластину в течение одного часа комнатной температуры, через час промойте лунки и затем в каждую хорошо добавьте по 100 микролитров двух микрограмм на миллилитр OX 68. Выдержите тарелку при комнатной температуре еще час. После второй инкубации проведите еще одну серию промывки и загрузите в планшет антиамериканскую щелочную фосфатазу.

Выдержите в тарелке третий час комнатной температуры. Теперь вымойте тарелку три раза в PBST и дайте ей окончательно вымыть PBS. Чтобы удалить остатки моющего средства, добавьте 100 микролитров одного миллиграмм на миллилитр субстрата 1 0 4 в буфер из ди этанола через час.

При измерении поглощения при комнатной температуре 4 0 5 нанометров Элиза обнаружила серию разведения четырех различных диализованных супинатов приманки с использованием моноклонального антитела против CD с четырьмя метками. Если неразбавленных экспресс-белков приманки недостаточно для насыщения всех участков связывания биотина пластины, покрытой стрептококком ENC, то сконцентрируйте белок с помощью спинового концентратора Viva. В противном случае используйте прикормочный белок в разбавленной концентрации в PBST с 2% БСА.

Этого как раз достаточно, чтобы насытить сайт связывания биотина в анализе. Количественно оцените относительные уровни, на которых экспрессируются пребелки, используя активность фермента бета-лактамазы. Начните с создания серии разведения супината, содержащего парапротеины в буфере PBST 2% BSA.

Затем добавьте 20 микролитров разбавления к 60 микролитрам загруженного в тарелку раствора азотистого степина. Немедленно перенесите планшет в считыватель планшетов и измеряйте поглощение 4 85 нанометров один раз в минуту в течение следующих 20 минут с помощью центробежных концентраторов или разбавляющего PBST с 2% BSA. Установите окончательную концентрацию образцов для гидролиза всех нитр в анализе примерно за семь минут, что составляет около двух оборотов нитро в минуту.

Начните просеивание AveXis с промывки пластины со стрептококковым покрытием TAVR ENC в PBST и простукивания пластины бумажным полотенцем. Далее добавьте PBST с BSA в каждую лунку и инкубируйте тарелку в течение 30 минут. Это блокирует ложные сайты связывания белка.

Внутри каждого хорошо удалите блокирующий раствор умным движением тарелки над раковиной и добавьте 100 микролитров нормализованной биотинилированной мономерной приманки в соответствующие лунки. Выдержите тарелку в течение часа при комнатной температуре. Затем еще одним движением снимите образцы приманки с тарелки и трижды смойте ее PBST.

Затем вытрите насухо после третьей стирки. Теперь добавьте в каждую лунку по 100 микролитров нормализованного пентамера и выдержите тарелку при комнатной температуре в течение часа. Через час дайте тарелке еще три промывки с PBST и последнюю промывку только с PBS.

Наконец, добавьте 60 микролитров раствора азотистых семи в каждую лунку и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение двух часов, или лучше инкубируйте планшеты в течение 16 часов при четырех градусах SIU. На следующий день позитивные взаимодействия станут красными. Сфотографируйте пластину для визуальной записи, а затем количественно оцените реакции при поглощении 4 85 нанометров с помощью считывателя пластин.

Примерно через 10 минут после начала реакции скрининга AveXis наблюдались изменения цвета от желтого до красного как в контроле захвата добычи, опосредованном антителами, так и в положительном контроле взаимодействия. Такое изменение цвета указывает на гидролиз азота в субстрате. Некоторые положительные взаимодействия можно наблюдать в этой временной шкале, но для появления большинства потребовалось несколько часов.

Как правило, наблюдается частота попаданий от 0,4 до 0,6% положительных результатов. После того, как белковые библиотеки подготовлены, можно быстро провести скрининговую часть этого метода. Вполне возможно отсеять до 12 тарелок в день после выявления взаимодействия.

Наиболее важным следующим шагом является демонстрация того, что взаимодействие может быть повторено с использованием свежих независимых белковых препаратов. Во-вторых, мы всегда определяем, является ли взаимодействие независимым от ориентации приманки на добычу, то есть может ли оно быть взаимным? Это включает в себя клонирование доменов вектора приманки в вектор добычи и наоборот.

Взаимодействия, которые могут быть повторяющимися и взаимными, считаются высокодоверительными и всегда показывают положительные результаты. Используя другие методы, такие как поверхностный плазменный резонанс, мы предпочитаем использовать поверхностную плазму в резонансе для дополнительной проверки любых взаимодействий, которые мы повторно идентифицируем. Важно отметить, что это обеспечивает демонстрацию того, что два очищенных компонента могут взаимодействовать напрямую, а также может быть использовано для демонстрации того, что связывание является ситуативным и, следовательно, специфичным.