Микропипетки Стремление основания подключенных клетки к оценке сотовых жесткости

Целью следующего эксперимента является анализ вязкоупругих свойств клеток при различных физиологических и патологических условиях. Это достигается путем приложения отрицательного давления к клеточной мембране с помощью микропипетки, подключенной к датчику давления; микропипетка изготовлена из стеклянных капилляров с использованием вытягивателя микропипеток. Пипетка закреплена на прецизионном микроманипуляторе, расположенном на предметном столике перевернутого микроскопа, после чего кончик пипетки подводится вплотную к клетке.

Затем между наконечником пипетки и клеточной мембраной создается герметичное соединение, после чего измеряется деформация мембраны, втягиваемой в пипетку, в ответ на приложенный ступенчатый отрицательный избыточный压力. Полученные результаты демонстрируют влияние различных воздействий на биомеханические свойства клеток, исходя из степени деформации мембраны в ответ на точно определенную силу. Целью нашей лаборатории является изучение влияния дислипидемии на биофизические и биомеханические свойства эндотелиальных клеток сосудов, и сегодня мы расскажем вам о методе, который называется аспирацией с помощью микропипетки и который мы используем для измерения жесткости клеток.

Значимость данного метода распространяется на фундаментальное понимание клеточной биомеханики в рамках различных процессов, таких как ангиогенез, механосенсорика, миграция и другие. Хотя этот метод позволяет изучить биомеханику клеток, его также можно применять к другим системам, таким как модельные мембраны, внутриклеточные органеллы или ткани. Для визуализации клеточной мембраны и наблюдения за ее выпячиванием в пипетку мембраны эндотелиальных клеток сосудов окрашивают липофильным флуоресцентным красителем.

Для начала разбавьте стоковый раствор красителя до рабочей концентрации, используя подогретый раствор PBS, затем обработайте смесь ультразвуком в течение пяти минут для разрушения агрегатов красителя. После центрифугирования в микроцентрифуге в течение пяти минут удалите супернатант. Промойте эндотелиальные клетки сосудов, добавив 0,5 мл PBS. Через пять минут аспирируйте раствор и повторите промывку еще дважды.

Затем добавьте раствор dice к клеткам и инкубируйте в течение 30 минут в инкубаторе при температуре 37 °C. После инкубации снова промойте клетки раствором PBS, как указано ранее. Микропипетки изготавливают путем нагревания стеклянного капилляра в центре.

Когда стекло начинает плавиться, две половины капилляра раздвигаются для формирования двух микропипеток. Диаметр кончиков пипеток, используемых в данных экспериментах, обычно составляет от двух до шести микрон. В зависимости от размера клетки, форма кончика должна быть приближена к цилиндрической трубке; для этого необходимо вставить стеклянный капилляр в вытяжку для пипеток.

В данной демонстрации используется горизонтальный вытягиватель пипеток Suter P 97 с оптимизированной программой. Этот вытягиватель предлагает множество программируемых опций для изменения скорости и других параметров вытягивания. Перейдите к активации программы вытягивания.

После вытягивания каждой микропипетки проверьте форму кончика под микроскопом. После огневой полировки кончика заполните микропипетку физиологическим раствором, таким как PBS, или нефлуоресцентной ростовой средой. Важно, чтобы раствор содержал 30% сыворотки, что обеспечит плавное перемещение клеточной мембраны в пипетку. В данной демонстрации используется инвертированный флуоресцентный микроскоп с возможностью 3D-деконволюции, подключенная к компьютеру видеокамера, датчик давления, виброизоляционный стол и микроманипулятор. Для начала поместите клетки в камеру микроаспирации, подняв их с подложки и перенеся пипеткой в неглубокую продольную камеру, установленную на инвертированном флуоресцентном микроскопе.

Обоснованием использования малоглубокой продольной камеры является необходимость обеспечить подход микропипеты к клеткам под очень малым углом, максимально близким к горизонтальному. Это делается для того, чтобы мембрана, втянутая в микропипетку, находилась в одной плоскости фокусировки. Поместите заполненную микропипетку в держатель для пипеток, соединенный с силовым преобразователем с помощью гибкой трубки, диаметр которой подобран под разъем держателя для обеспечения плотного прилегания.

В начале каждого эксперимента давление в пипетке уравновешивают с атмосферным давлением, затем пипетку устанавливают на микроманипулятор, который обеспечивает точный контроль перемещений пипетки в микронном диапазоне. Располагают пипетку под небольшим углом к дну камеры и подводят кончик пипетки к центру поля зрения. Стержень пипетки — цилиндрическая часть наконечника, в которую втягивается мембрана, — должен быть расположен горизонтально относительно фокальной плоскости.

Чтобы занять это первое положение, установите пипетку под максимально возможным пологим углом, а затем прижмите стержень пипетки к дну камеры. Поскольку стержень очень тонкий, он достаточно гибкий, чтобы скользить по дну камеры при приближении к клетке. Медленно опускайте микропипетку к краю отдельной клетки с помощью грубого манипулятора, пока она не окажется почти в плоскости фокуса клетки.

Затем с помощью прецизионного манипулятора переместите микропипетку к краю клетки, пока кончик пипетки осторожно не коснется мембраны. Сделайте один снимок, чтобы проверить положение пипетки. Качественное уплотнение достигается тогда, когда весь кончик пипетки полностью прилегает к поверхности клетки и контакт остается стабильным.

Затем, используя преобразователь, создайте отрицательное давление и поддерживайте его до стабилизации проекции мембраны. Величина давления, необходимая для аспирации мембраны в пипетку, варьируется в зависимости от типа клеток и конкретных условий эксперимента. Начальная деформация обычно наблюдается при создании давления в диапазоне от -2 до -15 мм ртутного столба.

При приложении давления мембрана постепенно деформируется в сторону пипетки, пока ее длина не стабилизируется. Этот процесс обычно занимает от двух до трех минут; в течение этого времени каждые 30 секунд необходимо делать снимки деформации мембраны, чтобы отслеживать продвижение мембраны, втягиваемой в пипетку. Затем увеличьте давление до следующего уровня с шагом от двух до пяти мм рт ст.

Повторяйте всю процедуру до тех пор, пока мембранный выступ не отделится от клетки и не переместится внутрь пипетки, после чего эксперимент прекращается. Для количественной оценки степени деформации мембраны измеряют длину аспирации от кончика пипетки до вершины окружности мембранного выступа. Пипетка большего диаметра будет оказывать большее воздействие на мембрану клетки при том же уровне давления, что позволяет учитывать различия между диаметрами пипеток.

Длина аспирации нормируется по диаметру пипетки, измеренному для каждого эксперимента, чтобы подтвердить применимость метода микроаспирации для клеток, прикрепленных к субстрату; было проверено, что разрушение F-актина приводит к снижению жесткости эндотелиальных клеток аорты быка, согласно оценкам данного метода. Здесь представлена типичная серия флуоресцентных изображений эндотелиальной мембраны, подвергающейся прогрессирующей деформации в ответ на отрицательное давление, прикладываемое через микропипетку, что соответствует ожидаемому результату. Мембрана постепенно втягивается в пипетку, и длина аспирации увеличивается в зависимости от приложенного давления; временные профили деформации показывают, что разрушение F-актина значительно увеличивает длину аспирации выступов при всех условиях давления.

С помощью этого подхода было обнаружено, что жесткость клеток увеличивается при истощении клеточных мембран холестерином, в то время как обогащение холестерином не оказывало влияния. Здесь показаны клетка, обогащенная холестерином, контрольная клетка и клетка с дефицитом холестерина после достижения максимальной длины аспирации при давлении минус 15 миллиметров ртутного столба. Выступания обычно начинали развиваться при минус 10 миллиметрах ртутного столба, и время возникновения деформации мембраны можно было измерить для отрицательного давления 10, 15 и 20 миллиметров ртутного столба.

Здесь представлены графики максимальной длины аспирации в зависимости от приложенного давления. Максимальная нормированная длина в истощенных клетках была значительно ниже, чем в контрольных клетках, при давлениях минус 15 мм рт ст и минус 20 мм рт ст. Приложение отрицательного давления выше 25 мм рт ст приводило к отделению аспирированного отростка с образованием отдельного сгустка.

Уровень давления, при котором происходило отсоединение мембраны, был схожим при различных условиях содержания холестерина, что стало неожиданным наблюдением. Поскольку предыдущие исследования показывают, что увеличение содержания холестерина в мембране повышает жесткость липидных бислоев мембраны. После освоения эта методика может быть выполнена за два-три часа при условии правильного проведения. При выполнении данной техники важно помнить, что эксперимент проводится на отдельных клетках.

Таким образом, в рамках каждого эксперимента для каждого условия следует проанализировать от трех до пяти клеток, проведя в общей сложности три эксперимента.