Техника для TIRF микроскопии в реальном времени, одновременная съемка TCR и его ассоциированных сигнальных белков
22 марта 2012 г.
Фрагментации белков либо в мембране или в местах внутриклеточного является одним регулирующим механизмом, который может существенно влиять сигнализации результаты, поэтому, чтобы понять, сигнализация важно для изучения пространственных и временных поведение белков, участвующих. Мы описываем здесь TIRF микроскопии система для изучения передачи сигнала в Т-клетках, но широкого применения.
В данном видео описывается процедура отслеживания событий передачи сигналов Т-клеточных рецепторов с использованием одновременного сбора данных по двум каналам. С помощью флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRF-микроскопии) сначала проводят трансфекцию Т-клеток плазмидой, кодирующей ZAP 70 с GFP-меткой, затем подготавливают поддерживаемый стеклом липидный бислой, который включает липидно-якорные пептидные комплексы MHC, адгезивные молекулы и костимулирующие молекулы.
T-клетки, трансфектированные ZAP 70, добавляют к бислою в момент взаимодействия T-клеточных рецепторов с пептид-MHC-комплексами. Ассоциированные с T-клеточным рецептором цепи CD3 фосфорилируются киназой LCK из семейства SARC, после чего киназа zap 70 рекрутируется из цитоплазмы. Затем T-клеточный рецептор маркируют флуоресцентным красителем и проводят визуализацию, при которой клетки погружены в среду с более низким показателем преломления, чем у покровного стекла, и освещаются лазерным лучом под углом, обеспечивающим полное внутреннее отражение.
Это создает затухающую волну на границе раздела стекло-вода, которая экспоненциально затухает в среде, обеспечивая глубину проникновения от 100 до 200 нанометров. Таким образом, возбуждаются только флуорофоры в плазматической мембране или расположенные очень близко к ней. Анализ полученных изображений показывает, что передача сигналов происходит в микрокластерах Т-клеточных рецепторов.
Основным преимуществом микроскопии TIRF или традиционной конфокальной микроскопии является получение более высокого разрешения, что позволяет легко визуализировать сигнальные кластеры или сигнальные комплексы, такие как микрокластеры TCR. Трэвис Крайтс и Чень, оба постдока в моей лаборатории, продемонстрируют, как трансфицировать первичные T-клетки мыши с помощью технологии Maxi Nucleofection, а затем визуализировать их с помощью микроскопии общего внутреннего отражения (TIRF-M) при стимуляции поддерживаемым стеклом липидным бислоем, содержащим антиген.
Этот метод широко использовался для изучения сигнальных путей в различных иммунных клетках, включая Т-клетки, В-клетки, естественные киллеры и мастоциты. Метод обладает широкой применимостью и может быть использован для изучения большинства рецепторных систем в клетках млекопитающих, особенно если сигнализация происходит в кластерах. Специалисты, впервые применяющие этот метод, могут столкнуться с определенными трудностями, так как Т-клетки очень трудно трансфецировать.
Кроме того, требуется точная координация, чтобы жизнеспособность Т-клеток и эффективность трансфекции, качество биляров, а также юстировка микроскопа соответствовали необходимым параметрам. Первый этап данной процедуры заключается в трансфекции наивных или активированных in vitro первичных Т-клеток экспрессионными плазмидами и кодирующими сигнальными молекулами с GFP-меткой с использованием набора AM maxa mouse T-cell nucleo effector kit. Все Т-клетки, использованные в данном исследовании, экспрессировали A-N-D-T-C-R, который распознает пептид MCC, связанный с молекулой MHC IE мыши K. Процедура трансфекции, представленная здесь, проводится в соответствии с рекомендациями производителя.
Тем не менее, ниже приведены рекомендации, способствующие повышению жизнеспособности T-клеток после трансфекции. Жизнеспособность и эффективность трансфекции выше в T-клетках, активированных in vitro, чем в наивных клетках, поэтому в данном протоколе перед началом работы используются активированные in vitro T-клетки. Для каждой трансфекции приготовьте два миллилитра дополненной среды для T-клеток, смешав в пробирке объемом два миллилитра 1,9 миллилитра среды, входящей в набор, 20 µL компонента A, 20 µL компонента B и 100 µL фетальной бычьей сыворотки.
Перенесите по два миллилитра среды в каждую лунку 12-луночного планшета. Поместите планшет в увлажненный инкубатор при температуре 37 °C минимум на один час для уравновешивания среды; холодная среда или среда с pH, отличным от 7.2, приведет к гибели клеток при ресуспендировании трансфицированных клеток. Для приготовления смеси для трансфекции соедините 82 мкл раствора NucleoEffector для Т-клеток мыши, 18 мкл добавки 2 и 5 мкг плазмидной ДНК, свободной от эндотоксинов, при концентрации не менее 0,5 мкг/мкл; тщательно перемешайте путем осторожного постукивания.
Перенесите от 5 до 10 миллионов клеток в центрифужную пробирку объемом 15 мл, центрифугируйте при 75 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре. Используя вакуумный аспиратор, удалите как можно больше супернатанта, чтобы ресуспендировать клеточный осадок в смеси для трансфекции; осторожно и медленно аспирируйте клеточный осадок три-четыре раза, пока не исчезнут крупные скопления клеток. С помощью пипетки осторожно перенесите суспензию в сертифицированную кювету amaxa, убедившись в отсутствии пузырьков воздуха.
Выберите программу ядерного эффектора qve select nuclear effector program X 0 0 1 на устройстве ядерного эффектора. Вставьте vete в держатель Q vete и нажмите кнопку для применения выбранной программы. Затем немедленно перенесите vete и предварительно уравновешенную культуральную среду в вытяжной шкаф.
С помощью прилагаемой пластиковой пипетки добавьте примерно 500 microliters предварительно уравновешенной среды в лунку. Затем добавьте суспензию клеток в среду в планшете, при этом вносите раствор по каплям.
Инкубируйте клетки при 37 °C в течение четырех часов, чтобы обеспечить низкий уровень экспрессии белков с GFP-меткой и минимизировать появление артефактов, вызванных гиперэкспрессией. В данном разделе описывается метод юстировки микроскопа для одновременной двухканальной визуализации перед включением всех компонентов микроскопа. Запустите компьютер и программное обеспечение.
Затем убедитесь, что все аппаратные компоненты распознаны программным обеспечением. Поскольку программное обеспечение запускается без сообщений об ошибках, все компоненты были обнаружены. Разведите один мкл суб-разрешения.
Добавьте яркие многоцветные флуоресцентные микросферы Flores в 2 мл PBS для использования в качестве стандарта колокализации. Затем добавьте по 0,25 мл суспензии микросфер в каждую лунку системы предметных стекол с восьмилуночной камерой от Lab Tech. Поместите систему камерных слайдов на платформу над объективом.
Затем сфокусируйте изображение бусин, адсорбированных на стекле, в режиме предварительного просмотра в реальном времени. В левой панели будет отображаться канал, в котором видны трансфицированные GFP-клетки. В правой панели во время экспериментов по визуализации живых клеток будут видны меченые TCR.
Используя регулировку по оси Y в системе XY, Z для ввода волокна, отрегулируйте положение лазерного луча так, чтобы он выходил из объектива и проецировался на потолок. Важно выполнять эту операцию, когда объектив находится в положении, при котором стеклянная плоскость находится в фокусе. Если пятно луча на потолке рассеянное, значит, луч не сколлимирован.
Отрегулируйте Z-микрометр для достижения полной коллимации теста коллимации для каждой из лазерных линий, которые будут использоваться в эксперизме. Затем, используя измеритель мощности лазера, установите мощность лазера в диапазоне от 20 до 30 micro watts для каждого канала. Т-клетки чрезвычайно чувствительны к лазерному излучению, поэтому общая суммарная мощность освещения ограничена 50 micro watts.
Далее необходимо настроить угол наклона для газона. Поворачивайте микрометр юстировки по оси Y на вводе волокна, чтобы сместить луч от потолка, пока угол его оптической оси относительно объективов не приблизится к 90 градусам.
Когда будет достигнут критический угол полного внутреннего отражения, лазерный свет перестанет выходить из объектива. Чтобы оценить, достигнута ли юстировка «турфа», перемещайте фокус вверх и вниз через плоскость покровного стекла. Обратите внимание, что когда адсорбированные на поверхности микросфер выходят из фокуса, можно увидеть множество микросфер, плавающих в растворе. Для достижения качественной юстировки «турфа» необходимо увеличить угол наклона луча относительно объектива.
При увеличении угла наклона луча микросферы, плавающие у поверхности, начинают исчезать, а интенсивность сигнала от микросфер, адсорбированных на границе раздела, возрастает. Теперь, когда адсорбированные на границе раздела микросферы выводятся из фокуса, плавающие в растворе микросферы перестают быть видимыми. В этот момент достигается правильная юстировка, так как в фокусе могут находиться только микросферы, адсорбированные на покровном стекле.
Затем, чтобы совместить красный и зеленый флуоресцентные каналы друг с другом, сфокусируйтесь на микросферах и сравните положение идентифицируемых признаков на изображениях, полученных в обоих каналах. Используя микрометрические винты по осям X и Y на одной из штатив-подставок камер, максимально приблизьте относительное положение микросфер. Обратите внимание на яркую микросферу в нижнем левом квадранте обоих изображений, чтобы обеспечить пространственное совмещение двух каналов.
Этот объект приводится в одно и то же относительное положение на обоих изображениях. Выполните захват и сохраните изображение с обоих каналов. Эти изображения будут использоваться в качестве стандарта колокализации для совмещения двух каналов.
Пример такого совмещения представлен здесь до проведения процедуры. Один из каналов повернут относительно другого, что видно на данном изображении, где наложены друг на друга снимки субразрешающих частиц в двух каналах. После выполнения настроек изображения совмещены, как показано здесь.
Качество совмещения можно дополнительно проверить, сравнив изображения живых клеток, трансфицированных GFP. Обратите внимание, что изображения Laila с двух каналов идеально совмещены. Совмещение двух изображений было выполнено с использованием калибровки, установленной с помощью флуоресцентных микробусин.
После настройки микроскопа подготавливают проточные камеры, содержащие поддерживаемые стеклом липидные бислои с антигенами, и проводят визуализацию трансфицированных T-клеток, взаимодействующих с субстратом. Согласно протоколу, описанному Аной и Дастином, собирают проточную камеру с плоскими липидными бислоями, сформированными на предметном стекле с Ni-NTA-липидами, молекулой адгезии ICAM-1 и пептидно-MHC-комплексами. Загруженные MCC IEFK включаются в бислой с помощью гистидиновых меток.
Вводится костимулирующая молекула CD 80. Используя GPI-якорь, поместите проточную кювету на предметный столик микроскопа и зафиксируйте ее, прикрепив камеру к адаптерной пластине столика микроскопа с помощью натяжной планки для иммобилизации. Затем установите на проточную кювету нагревательный элемент, поставляемый производителем, для контроля температуры.
Поместите объектив над бислоем и настройте фокусировку на плоскость бислоя, чтобы обеспечить нагрев объектива и проточной кюветы; включите нагреватели проточной кюветы и объектива, чтобы довести температуру в камере до 37 °C. После четырех часов инкубации перенесите трансфицированные T-клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при скорости 80 ×g. Ресуспендируйте клетки в 300 µL буфера H-B-S-B-S-A. Затем добавьте FAB H 57 или одноцепочечный вариабельный фрагмент H 57 для маркировки TCR до конечной концентрации 10 µg/mL для FAB или 20 µg/mL для одноцепочечного вариабельного фрагмента.
Перенесите клетки в пробирку Фалькона объемом 5 мл. Затем с помощью шприца с одномиллилитровым наконечником введите клетки в проточную камеру через трехходовой клапан. Настройте параметры визуализации таким образом, чтобы при двухканальном режиме сбора данных в реальном времени отображалось предварительное изображение каналов TCR и GFP, и найдите поле с трансфецированными клетками.
Из-за разницы в интенсивности сигналов TCR и GFP может потребоваться корректировка масштаба изображений в режиме реального времени, чтобы клетки были видны в обоих каналах. Как показано в данном случае, подтвердите освещение «дерна» (turf), перемещая плоскость фокусировки вверх по стеклу для обнаружения любого окрашивания латеральных мембран. Если латеральные мембраны не попадают в фокус, значит, юстировка «дерна» выполнена правильно.
На этом предварительном просмотре в режиме реального времени окрашивание латеральной мембраны отчетливо видно как в плоскости покровного стекла, так и при расфокусировке покровного стекла для достижения оптимальной настройки микроскопа по оси Z. Угол лазера относительно объектива увеличивается, и латеральная мембрана выходит из фокуса. Начните захват отдельных изображений и последовательностей таймлапс-съемки с интервалом в 10 секунд.
Клетки инкубировали в течение пяти минут на стеклянных подложках с бислоями INTA, содержащими 6 молекул на квадратный микрометр пептида с His-тегом IEFK, 100 молекул на квадратный микрометр конъюгата Alexa 647 с His-тегом ICAM-1 и 100 молекул на квадратный микрометр GPI-якорного CD80. Двухканальный одновременный сбор данных с помощью TIRF-микроскопии проводили при постоянном присутствии конъюгата Alexa 546 с FAB-фрагментом H57.
Для окрашивания Т-клеточного рецептора (TCR) клетки визуализировали в течение одного часа после первоначального контакта с бислоем. Количество кластеров ZAP 70 на одну клетку анализировали с помощью программного обеспечения для автоматического подсчета кластеров. В каждом случае анализировали не менее 40 клеток.
Загруженные пептиды указаны на врезке. ICAM-1 относится к клеткам на бислоях, содержащих 100 молекул на квадратный микрометр конъюгированного с Alexa 647 His-меченого ICAM-1. Как показано на рисунке, zap-70-зависимая сигнализация происходит в микрокластерах TCR и только в ответ на агонистические лиганды, что видно в данном видео, снятом с частотой 10 секунд на кадр.
Сигнализация TCR в ответ на агонистические пептиды поддерживается за счет непрерывного образования микрокластеров TCR на периферии зоны контакта, которые рекрутируют ZAP 70. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как трансфицировать первичные Т-клетки с использованием технологии MaxAct для доставки в ядро и правильно визуализировать рекрутирование сигнальных молекул GFP в микрокластеры TCR с помощью TIRF-микроскопии. При должном освоении эта методика может быть выполнена за семь часов, если соблюдать все инструкции.
При выполнении данной процедуры важно крайне бережно обращаться с первичными клетками. Чем здоровее будут клетки на каждом этапе эксперимента, тем выше будет эффективность трансфекции и тем большее количество клеток удастся зафиксировать при визуализации. Т-клетки обладают высокой подвижностью, и в результате последовательная визуализация каналов TCR и GFP приводит к неточному совмещению двух изображений из-за перемещения микрокластеров TCR и самих клеток.
Для решения этой проблемы мы разработали двухканальный микроскоп для одновременной регистрации сигналов с поверхности ткани (turf microscope).
Обзор
В данной статье представлен метод отслеживания событий передачи сигналов T-клеточного рецептора с помощью микроскопии общего внутреннего отражения (TIRF). Этот метод позволяет визуализировать сигнальные комплексы в T-клетках, предоставляя информацию о пространственной и временной динамике белковых взаимодействий.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Иммунология
Теоретические сведения
- Понимание компартментализации белков имеет решающее значение для изучения сигнальных путей.
- Микроскопия TIRF позволяет получать изображения белковых взаимодействий с высоким разрешением.
- Сигнальные события в Т-клетках необходимы для иммунного ответа.
- Предыдущим методам не хватало разрешения для эффективной визуализации микрокластеров.
Цель исследования
- Продемонстрировать систему на основе TIRF-микроскопии для изучения сигналинга Т-клеточного рецептора.
- Представить протокол трансфекции Т-клеток сигнальными молекулами, меченными GFP.
- Осветить преимущества TIRF-микроскопии по сравнению с традиционными методами.
Используемые методы
- Трансфекция первичных Т-клеток мыши ZAP-70 с GFP-меткой.
- Подготовка поддерживаемого стеклом липидного бислоя с пептид-MHC комплексами.
- Визуализация микрокластеров Т-клеточных рецепторов с помощью TIRF-микроскопии.
- Анализ сигнальных событий посредством одновременного двухканального сбора данных.
Основные результаты
- Успешная визуализация микрокластеров Т-клеточных рецепторов в процессе передачи сигнала.
- Демонстрация повышенного разрешения при использовании TIRF-микроскопии по сравнению с конфокальной микроскопией.
- Идентификация ключевых событий передачи сигнала и белковых взаимодействий в Т-клетках.
- Рекомендации по протоколу для повышения жизнеспособности Т-клеток и эффективности трансфекции.
Выводы
- Микроскопия TIRF является мощным инструментом для изучения динамики сигналинга Т-клеток.
- Данный метод широко применим к различным рецепторным системам в клетках млекопитающих.
- Дальнейшие исследования могут использовать эту методику для изучения сигналинга иммунных клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод TIRF-микроскопии позволяет осуществлять одновременную визуализацию TCR и связанных с ним сигнальных белков в режиме реального времени, обеспечивая критически важное пространственное и временное разрешение для валидации мишеней на ранних этапах иммунологических исследований. Визуализируя формирование микрокластеров TCR и последующие сигнальные события, такие как привлечение Zap70, данный метод способствует механистическому снижению рисков при проверке терапевтических гипотез, касающихся путей активации T-клеток. Этот подход повышает точность прогнозирования при идентификации ведущих соединений, позволяя напрямую наблюдать белковые взаимодействия на плазматической мембране в физиологически релевантных условиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять гипотезы о сигнализации TCR путем визуализации привлечения сигнальных белков, таких как Zap70, в микрокластеры TCR в режиме реального времени.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней посредством прямого наблюдения за активацией киназ и фосфорилированием адаптерных белков в живых T-клетках.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени, связывая взаимодействие с лигандом с формированием нижележащего сигнального комплекса с помощью количественного метода визуализации.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать стандартизированные количественные данные, такие как число кластеров Zap70 на клетку, с помощью автоматизированного анализа, что обеспечивает воспроизводимые условия скрининга.
- Масштабируемость: одновременный сбор данных в двух каналах позволяет параллельно контролировать связывание рецепторов и привлечение сигнальных белков, что увеличивает пропускную способность при оценке соединений или лигандов.
- Воспроизводимость: протоколы юстировки микроскопа с использованием стандартов в виде флуоресцентных микросфер обеспечивают согласованную регистрацию каналов в разных экспериментах и для разных пользователей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между этапом ранних открытий и доклинической валидацией, предоставляя релевантную модели заболевания систему для изучения динамики сигнализации TCR в определенных условиях стимуляции.
- Механистическое снижение рисков: позволяет выяснить, зависит ли наблюдаемая сигнализация от агонистических лигандов и происходит ли она специфически в микрокластерах TCR, что уменьшает неопределенность при интерпретации путей передачи сигнала.
- Согласованность с биомаркерами: способствует идентификации фосфорилизационно-зависимых событий сигнализации, которые могут коррелировать с функциональными ответами Т-клеток и результатами их дифференцировки.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум разработки лекарственных средств — от подтверждения взаимодействия с мишенью до ранней оптимизации соединений-лидеров, в частности для иммуномодуляторов, влияющих на передачу сигналов Т-клеточного рецептора.
- Фундаментальная биология: Облегчает проверку гипотез, позволяя визуализировать пространственную организацию и временную динамику сигнальных комплексов, связанных с TCR.
- Скрининг: Обеспечивает количественные данные на основе визуализации (например, формирование кластеров Zap70), что позволяет сравнивать эффективность различных лигандов или влияние генетических модификаций.
- Аналитика: Обеспечивает мультиплексный одновременный анализ локализации рецепторов и привлечения сигнальных белков, что позволяет сопоставить связывание с активацией.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность доклинических исследований путем моделирования формирования иммунологического синапса на поддерживаемых липидных бислоях с определенной презентацией антигена.
- Применимость в различных проектах: Метод адаптируем к различным рецепторным системам в клетках млекопитающих, где сигнализация происходит в кластерах, что способствует его использованию в разных исследовательских проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в передаче сигналов TCR путем прямой визуализации привлечения Zap70 в микрокластеры при взаимодействии с агонистом.
- Практическая ценность: Повышает воспроизводимость за счет стандартизированных протоколов трансфекции, подготовки липидного бислоя и процедур выравнивания двухканального изображения.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) в области иммунотерапии, предоставляя ранние механистические данные о взаимодействии с мишенью и инициации сигнала.
- Влияние на портфель разработок: Позволяет проводить приоритизацию кандидатов, нацеленных на TCR, с учетом рисков, основываясь на подтвержденной способности к передаче сигналов в физиологически контекстуализированной системе.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области трансфекции первичных Т-клеток и визуализации живых клеток в контролируемых условиях окружающей среды.
- Зависит от наличия микроскопической установки, совместимой с TIRF, с возможностью одновременного двухканального сбора данных и точностью юстировки лазера.
- Необходимо стандартизировать состав липидного бислоя и презентацию антигена для обеспечения стабильного взаимодействия с TCR в разных экспериментах.
- Требуется оптимизация эффективности трансфекции и жизнеспособности клеток, особенно с учетом чувствительности первичных Т-клеток к манипуляциям и артефактов, вызванных гиперэкспрессией.
- Ограничено необходимостью бережного обращения для поддержания жизнеспособности клеток и предотвращения смещения, приводящего к потере фокусировки при тайм-лапс визуализации.
