Шаг за шагом метод для разведения Transporter ABC в Nanodisc липидных частиц

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы включить транспортер A, b, C. В этом случае транспортер мальтозы малф GK два в растворимые мембранные нанодиск частицы. Это достигается путем предварительного смешивания мембранного каркасного белка MSP с транспортером и правильным количеством липидов в моющих моющих клетках.

Второй шаг заключается в добавлении гранул полистирола и осторожном покачивании смеси в течение ночи, моющее средство постепенно впитывается на гранулы, что позволяет образовывать частицы нанодиска. Далее бусины удаляются путем отстаивания. Заключительным этапом является отделение правильно сформированных дисков от агрегатов и несобранных белков каркаса с помощью гель-фильтрационной хроматографии.

Наконец, качество дисков оценивается с помощью нативного гель-электрофореза или спектроскопии рассеяния света. Основное преимущество этой методики перед другими методами, такими как липосомы, заключается в том, что мембранные белки и диски прекрасно растворяются в водном растворе. Кроме того, белковые домены теперь доступны с обеих сторон.

Поскольку в настоящее время больше нет мембранного компартмента Используя мембранный каркас белков разной длины, мне удалось поймать и изучить различные состояния связок мембранных белков. Самое главное, что этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мембранной протеомы, такие как идентификация новых партнеров по связыванию транспортеров a, b, c. На самом деле, применение этого метода распространяется и на терапию, потому что он может помочь в открытии активаторов или ингибиторов мембранных белков и рецепторов.

Хотя этот метод кажется простым, следует соблюдать осторожность при выборе правильного соотношения белковых липидов. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности с расчетом правильного соотношения формовщиков или выполнением правильного контроля, обеспечивающего качество приготовления. Поэтому наглядная демонстрация этого метода очень полезна для нового студента, чтобы узнать о различных шагах и потенциальных трудностях.

Для начала меченный гнекса гистидин MSP в штамме кишечной палочки BL 21 DE через три раза из плазмиды P MSSP 1D индуцировал производство белка, когда измеренная оптическая плотность на 600 нанометрах составляет около 0,5 в течение трех часов при 37 градусах Цельсия, собрать клетки центрифугированием при 5000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Повторно суспендируйте гранулу в буфере TSG 10, содержащем 100 микромолярных PMSF, трижды обработайте клетки французским прессом при 8 000 PS. Я удаляю нерастворимый материал центрифугированием при 5 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем изолируют растворимую фракцию, содержащую MSP, путем ультрацентрифугирования при давлении 125 000 G в течение 45 минут.

Очистите MSP с помощью хелатирующей хроматографии никеля с использованием приблизительно 1,5 миллилитров никелевого сероса высокой производительности в буфере TSG 10. Смойте загрязнения буфером T SG 10, содержащим 50 миллимолярный элюат ILE. MSP с буфером TSG 10, содержащим 600 миллимоляров I мидаза после диализа.

Очищенный белок в буфере TSG 10 MSP может храниться при температуре минус 70 градусов Цельсия и концентрации белка примерно от 10 до 15 миллиграммов на миллилитр. Комплекс MALF GK two, помеченный на С-конце MAL K, экспрессируется из плазмиды. PED 22 FG K, выращенный в штамме кишечной палочки BL 21 DE три индуцируют выработку белка при измеренной оптической плотности на глубине 600 нанометров около 0,5 с 0,2% L арабов в течение трех часов при 37 градусах Цельсия после лизиса клеток и центрифугирования.

Как и раньше, мы суспендируем мембранную гранулу в буфере TSG 20 до конечной концентрации пять миллиграмм на миллилитр. Затем растворите материал с 1% веса на объем GDM в течение трех часов при четырех градусах Цельсия с легким встряхиванием. Удалите нерастворимый материал с помощью ультрацентрифугирования, так как для очистки MAL FTK два.

Затем соберите надосадочную жидкость, содержащую солюбилизированный мал FTK два комплекса и снова очистите с помощью хелатирующей хроматографии никеля. Далее очистите комплекс методом гель-фильтрации хроматографии в буфере TSGD на SUEx 200, HR ten threehundred колонки со скоростью потока 0,5 миллилитров в минуту. Для получения фосфолипидов экстракт общего липида кишечной палочки, растворенный в хлороформе, разделяют на 1000 аномальных аликвот в микрофишах с завинчивающейся крышкой, выпаривают растворитель под слабой струей азота и перегоняют далее в течение ночи в вакууме.

Затем высушите, растворите липидную пленку в буфере TS при пяти конечных концентрациях НМО и энергично сделайте вихрь, а затем пять раз импульсируйте ультразвуком в течение примерно пяти секунд. Растворенные липиды будут казаться слегка непрозрачными из-за их общей нерастворимости в водном буфере TS, но они должны оставаться во взвешенном состоянии. Добавьте ДДМ до конечной концентрации 0,5%К этому моменту раствор станет прозрачным, поместите липидную смесь на водяную баню и пульсируйте ультразвуком пять раз в течение примерно пяти секунд.

Липидная смесь может храниться при температуре четыре градуса Цельсия не более одной недели. Чтобы приготовить биобусины, поместите примерно от 10 до 15 миллилитров биобусин в 50-миллилитровую тубусу. Сначала промойте бусины с 50 миллилитрами 100% метанола.

Дайте шарикам осесть под действием силы тяжести, а затем аккуратно слейте раствор. Повторите процесс один раз для метанола, затем дважды для 95% этанола milli Q воды и, наконец, буфера TS. Начните нанодискретное построение путем разбавления MSP в буфере TSGD до конечной концентрации примерно семь миллиграммов на миллилитр или 0,3 миллимола.

Чтобы обеспечить успех эксперимента, важно выбрать правильное соотношение липидов и белков, которые будут смешиваться друг с другом. Смешайте примерно два М очищенного мальфа GK два комплекса в соотношении белка к MS P к липидам от одного к трем до 60 в буфере TSGD для получения конечного объема 300 микролитров здесь, образец избытка липидов в соотношении один к трем к 400 также готовят в качестве отрицательного контроля при 50 микролитрах биогранулированной суспензии к пробирке и инкубируют смесь в течение ночи на качающийся стол при температуре четыре градуса Цельсия на следующий день, осадить бусины под действием силы тяжести. Как только шарики осядут, проведите раствор через узкий кончик, чтобы избежать как можно большего количества биогранул.

Удалите крупные осадки ультрацентрифугированием при 100 000 GS в течение 20 минут. Приступайте к очистке дисков методом гелевой фильтрационной хроматографии, как это было выполнено ранее в буфере TSG 10. Затем введите Eloqua на ту же гелевую фильтрационную колонку, чтобы проверить стабильность препарата.

Затем объедините фракции, содержащие диски. Качество препарата оценивается с помощью нативного гель-электрофореза. Проанализируйте один микромоляр нанодисков, чтобы оценить качество восстановления.

Также оцените связывание mal E с mal ftk two complex, восстановленным в нанодисках. После электрофореза окрасьте гель синим кумаси на 10 минут и задержите примерно на один час. Для выполнения динамического рассеяния света или DLS сначала очистите нанодиски с помощью гель-фильтрационной хроматографии, как и раньше, с помощью SUEx 200 HR ten threehundred колонки со скоростью потока 0,1 миллилитра в минуту.

Пулируйте фракции, содержащие нанодиски, и концентрируйте примерно до 10 миллиграммов на миллилитр с помощью центробежного фильтра AmCon. Затем дважды отфильтруйте образец. Выполнение анализа с помощью DLS с помощью прибора dynapro nano star с данными подгонки кварца внутреннего объема в один микролитр.

Используя динамическое программное обеспечение для оценки диаметра и молекулярной массы частиц, определите активность A TPA двух восстановленных нанодисков FTK с помощью холометрического анализа. Сначала смешайте один микромоляр очищенных дисков и один миллимоляр а ТП с возрастающим количеством матр. Инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут.

Затем измерьте высвобождение неорганического фосфата на 660 нанометрах. Сравните количество выделяемого фосфата со стандартной кривой, полученной с помощью стандартного раствора фосфора. Нанодиски очищаются с помощью гель-фильтрационной хроматографии.

Хроматограмма показывает, что большинство восстановленных дисков элюируют в виде одного пика, в то время как диски, изготовленные с избытком липидов, элюируются в объеме пустоты, и в виде серии широких пиков, качество препарата диска дополнительно анализируется с помощью нативного гелевого электрофореза Диски, восстановленные с ограниченным количеством липидов, мигрируют в виде острой полосы на нативном геле. в то время как восстановленные в присутствии избытка липидов мигрируют в виде мазков. Анализ, проведенный DLS, показывает, что популяция диска однородна со средним радиусом 5,0 нанометров. Исходя из приближения DLS, восстановленные диски имеют кажущуюся молекулярную массу 215 килодальтон, восстановленные в присутствии избытка липидов имеют широко распределенные радиусы около 100 нанометров, что характерно для неоднородных образцов.

Активность комплекса MAL FTK two оценивают путем измерения скорости гидролиза TP и сродства к взаимодействующим партнерам, таким как мальтозосвязывающий белок, MAL E, мальтозосвязывающий белок. MAL E связывается с высоким сродством с транспортером MAL FTK two с помощью электрофореза без денатурации геля. Можно обнаружить комплекс между MAL E и MAL ftk two, стимуляция активности MAL KA TPA со стороны MAL E показана здесь как функция концентрации MAL e.

Изготовление нанодиска относительно просто, но небольшие отклонения от оптимальных условий могут привести к необратимой агрегации белков, как только она будет освоена, эта техника может быть выполнена менее чем за два дня. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о важности выбора правильного соотношения белковых липидов, потому что избыточное количество липидов приведет к образованию больших полидисперсных липосомных частиц. Именно поэтому крайне важно тщательно анализировать качество восстановленного материала с использованием методов, отличных от фильтрации геля, таких как спектроскопия рассеяния света, аналитическое ультрацентрифугирование или, проще говоря, нативный гель-электрофорез.

Помните, что тип фосфолипидов, входящих в состав диска, а также белок каркаса мембраны могут способствовать эффективности восстановления. Мы надеемся, что после просмотра этого видео вы хорошо поняли, как создавать растворимые и однородные нанодиски, содержащие выбранный вами мембранный белок. Удачи в ваших экспериментах.