Ретроградная Флуоресцентная маркировка Позволяет Целевые Внеклеточные единичные Запись с Выявленные Нейроны В естественных условиях

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы записать ответы отдельных единиц in vivo из идентифицированной популяции нейронов в негенетической модельной системе. Это достигается путем предварительного выполнения трепанации черепа, чтобы обнажить интересующую область мозга. Второй шаг заключается в использовании вольфрамовой проволоки для размещения флуоресцентного красителя в области, на которую проецируются целевые нейроны.

Далее краситель ретроградно транспортируется, что приводит к селективной маркировке проекционных нейронов. Заключительным этапом является запись с меченого аксона отдельного проекционного нейрона. В конечном счете, одноединичные внеклеточные записи используются для того, чтобы показать, как центральные сенсорные нейроны в интактной цепи реагируют на сенсорную стимуляцию in evo.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как нейросхемы обнаруживают разницу во времени синаптических входов за доли миллисекунды. Основным преимуществом этой методики перед существующими методами является возможность нацеливания на отдельные нейроны или даже аксоны и генетически недоступные системы. Недельные электрические рыбы используют электрические сигналы для связи и навигации.

Они различают сигналы от разных рыб, используя разницу в доли миллисекунды во времени синаптических входов. Мы задались вопросом, как нейроны предполагаемого компаратора времени в их электросенсорной цепи способны обнаруживать такие малые временные различия. Но эта техника также может быть применена к другим системам, таким как зрительные и слуховые сенсорные пути.

Его особенно трудно выводить из жидкостей из этих клеток из-за небольшого размера, плотного вплетения в окружающую ткань и пресинаптических окончаний, которые покрывают большую часть клеточного брюха Внутриклеточное введение красителя во время записи всей клетки. In vitro помечает одну клетку, чтобы направлять целевые записи из этого аксона. Аналогичным образом, ретроградный транспорт после инъекции внеклеточного красителя обеспечивает средства избирательной маркировки проекционных нейронов в поверхностных областях мозга.

Это может быть использовано для обеспечения визуального руководства для записи одного устройства in vivo. Чтобы подготовить иглу с кодом D, сначала электролитически заточите вольфрамовую проволоку диаметром 160 микрометров до конечного диаметра кончика иглы от пяти до 50 микрометров. Затем, в ночь перед экспериментом, закодируйте кончик иглы двухмиллимолярным раствором конъюгированного с декстраном 10 000 молекулярных масс красителя Alexa, чтобы вызвать общую анестезию.

Поместите рыб в воду аквариума с раствором MS 2 22 в концентрации 300 миллиграммов на литр, обездвижьте и электрически заставьте рыб замолчать, введя 100 микролитров цепа из расчета три миллиграмма на миллилитр в спинную мускулатуру тела. Далее заполните камеру записи водой из бака и поместите рыбу брюшной стороной вниз на платформу в центре камеры. Затем подайте аэрированный раствор MS 2 22 в дозе 100 мг на литр в одном-двух миллилитрах в минуту, поместив наконечник пипетки в рот

После этого стабилизируйте рыбу с помощью неподвижных стержней и воска с обеих сторон тела. Следите за состоянием здоровья рыб, проверяя непрерывный кровоток в глазных сосудах и нормальный цвет тела. Затем поверните платформу вдоль вертикальной оси.

Отрегулируйте один конец платформы так, чтобы одна сторона спинной поверхности головы рыбы была открыта над водой, в то время как остальная часть тела рыбы оставалась под водой. Положите небольшой кусочек салфетки Kim на любой непогруженный участок кожи, чтобы предотвратить высыхание. В этой процедуре нанесите 0,4% лидокаина на открытую поверхность головы с помощью ватной палочки.

Затем с помощью лезвия скальпеля разрежьте прямоугольный кусок кожной ткани размером примерно три миллиметра на пять миллиметров для рыбы ростом 6,2 сантиметра. Боковой край прямоугольника должен совпадать с центром глаза. Передний край прямоугольника должен находиться прямо позади глаза, а медиальный край прямоугольника должен быть как раз латеральнее средней линии.

Впоследствии удалите прямоугольник с помощью щипцов. Вырежьте дополнительно 2,5 миллиметра квадрата спереди, чтобы обнажить череп. Полностью очистите открытую поверхность черепа, соскоблив лишнюю ткань с помощью лезвия скальпеля.

Затем полностью высушите поверхность с помощью салфетки Кима и принудительного проветривания воздуха. Затем приклейте металлический столб к передней медиальной области черепа с помощью суперклея. Дождитесь полного высыхания клея.

Используйте стоматологическую бормашину с твердосплавным наконечником шаровой фрезы диаметром 0,5 миллиметра, чтобы нарисовать прямоугольник размером примерно два миллиметра на четыре миллиметра на черепе для рыбы длиной 6,2 сантиметра. После этого разрежьте периметр прямоугольника с помощью скальпеля и щипцов. Затем снимите кожу с черепа.

Чтобы обнажить мозг, разрежьте пигментированную твердую мозговую оболочку и прозрачную мозговую оболочку с помощью пружинных ножниц или иглы. Затем удалите отрезанные участки с помощью пары щипцов, чтобы обнажить переднее экстра-латеральное ядро и заднее экстра-латеральное ядро. Теперь расположите манипулятор с подготовленной ранее иглой с D-образным покрытием над целевой областью, содержащей интересующие аксоны.

Заднее экстралатеральное ядро в нашем случае быстро вводят иглу примерно на 25 микрометров в ткань. После того как краситель распылится в течение 15-30 секунд, втяните иглу обратно. Повторите то же самое с добавлением свежих иголок по мере необходимости.

Поместите каждый из них в разное место, чтобы краситель распределился по всей целевой области. Затем смойте излишки красителя из полости раствором Хикмана и подождите не менее двух часов для впитывания красителя и его транспортировки. Чтобы визуализировать интересующие аксоны, поместите записывающую камеру с рыбой под объектив вертикального эпифлуоресцентного микроскопа с фиксированным столиком.

Переключите дыхательный раствор на свежую воду из бака и поддерживайте тот же расход. Затем поместите один конец заземляющего провода в открытую полость мозга и подключите другой конец к земле записывающего головного столика. Далее поместите пару записывающих электродов рядом с основанием хвоста.

Затем подключите электроды к дифференциальному усилителю и записывающему устройству. Чтобы контролировать команду разряда электрических органов или EODC, подготовьте масштабированный эскиз области мозга, видимой при малом увеличении, включая крупные кровеносные сосуды в качестве ориентиров, чтобы определить точное местоположение помеченных аксонов. Чтобы сначала подтвердить размещение D, просмотрите всю ткань с помощью яркого освещения для ориентации.

Затем просмотрите его с помощью флуоресцентной подсветки. Заднее экстралатеральное ядро должно иметь диффузное мечение. После этого под большим увеличением расположите переднее дополнительное боковое ядро с сосудами в качестве ориентиров.

Подсвечивайте его флуоресцентным светом во время поиска помеченного аксона у поверхности, используя внешний диаметр один миллиметр и внутренний диаметр 0,58 миллиметра. Босиликатное капиллярное стекло с нитью накаливания. Потяните записывающий электрод с узким хвостовиком длиной пять миллиметров и диаметром наконечника от одного до 2,4 микрометра.

Заполните электрод отфильтрованным раствором Рикмана. Конечное сопротивление наконечника должно быть в диапазоне от 16 до 155 мегаом. Поместите электрод в держатель электрода с напорным отверстием.

Подключите его к головному столу, установленному на манипуляторе. Затем подключите головной столик к усилителю. Аналого-цифровое устройство сбора данных, не показанное на рисунке, подключает усилитель к компьютеру.

После этого подайте положительное давление 30 миллибар на электродную линию. Медленно продвигайте электрод по направлению к аксону от поверхности ткани. Поскольку электрод находится близко к аксону, положительное давление должно вызывать небольшое, но заметное движение аксона, пока электрод находится рядом с аксоном.

Запишите активность во время предъявления тестовых стимулов. Хотя электрический артефакт подтверждает надлежащую регистрацию и стимуляцию, потенциалов действия быть не должно. Сбросьте внешнее давление в электроде и повторите стимуляцию и запись.

Затем примените небольшое всасывание, в результате чего аксон переместится в электрод. Повторите стимуляцию и запись еще раз. Теперь вы должны увидеть некоторые потенциалы действия в ответ на стимуляцию.

Как только потенциалы действия станут видимыми, закройте линию давления. Когда все необходимые записи будут завершены, переключите воду в аквариуме обратно в дыхательный раствор с MS 2 22 в дозе сто миллиграммов на литр, чтобы обеспечить полную анестезию рыб. Не следует обнаруживать EODC в течение как минимум 10 минут перед усыплением рыбы.

Вот пять образцов трасс, показывающих потенциалы действия, вызванные монофазным контралатеральным положительным поперечным квадратным импульсным стимулом 0,1 миллисекунды и шестью милливольтами на сантиметр, а вот растровый график, показывающий время пика во время 20 повторений 75-миллисекундного окна записи для того же блока, стимулируемого в момент нуля с шестью милливольтами на сантиметр. Диапазон длительностей указан справа. Здесь показана кривая настройки длительности стимула, которая количественно определяет реакции в виде пиков на повторение стимула.

После освоения операция и инъекция красителя, показанные в этой технике, могут быть выполнены в течение одного часа, если она выполнена правильно, а запись может быть начата через два-три часа после введения красителя. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о тщательном контроле за здоровьем подопытного животного после этой процедуры. Другие методы, такие как двухфотонная визуализация, могут быть выполнены для того, чтобы записывать нейроны в еще более глубоких структурах мозга.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как маркировать и записывать одиночные ответы от идентифицированной популяции нейронов.