Ретроградная Флуоресцентная маркировка Позволяет Целевые Внеклеточные единичные Запись с Выявленные Нейроны

Общая цель данной процедуры заключается в регистрации ответов отдельных нейронов in vivo из идентифицированной популяции нейронов в негенетической модельной системе. Это достигается путем первоначального выполнения краниотомии для обнажения интересующей области мозга. Вторым шагом является использование вольфрамовых электродов для введения флуоресцентного красителя в область, в которую проецируются целевые нейроны.

Затем краситель транспортируется ретроградно, что приводит к селективному мечению проекционных нейронов. Заключительным этапом является запись от меченого аксона отдельного проекционного нейрона. В конечном итоге используются внеклеточные записи отдельных единиц, чтобы показать, как центральные сенсорные нейроны в интактной цепи реагируют на сенсорную стимуляцию в evo.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как нейронные цепи обнаруживают субмиллисекундные различия во времени поступления синаптических сигналов. Основным преимуществом данной техники перед существующими методами является возможность воздействия на отдельные нейроны или даже аксоны, а также на системы, недоступные для генетического воздействия. Слаботоковные рыбы используют электрические сигналы для коммуникации и навигации.

Они различают сигналы от разных рыб, используя субмиллисекундные различия в синхронизации синаптических входов. Мы задались вопросом, каким образом предполагаемые нейроны-компараторы времени в их электросенсорной цепи способны обнаруживать столь малые временные различия. Однако этот метод может быть применен и к другим системам, таким как зрительные и слуховые сенсорные пути.

Выделить эти клетки особенно трудно из-за их малого размера, плотного расположения в окружающих тканях и пресинаптических терминалей, которые покрывают большую часть тела клетки. Внутриклеточная инъекция красителя во время записи от всей клетки in vitro позволяет пометить отдельный нейрон для проведения направленной записи с этого аксона. Аналогично, ретроградный транспорт после экстраклеточной инъекции красителя позволяет селективно маркировать проекционные нейроны в поверхностных областях мозга.

Это может быть использовано для визуального ориентирования при проведении записей отдельных нейронов in vivo. Для подготовки иглы с кодировкой D сначала проведите электролитическое заострение вольфрамовой проволоки диаметром 160 µm до конечного диаметра кончика иглы от 5 до 50 µm. Затем, накануне эксперимента, покройте кончик иглы 2 mM раствором декстрана с молекулярной массой 10 000 Da, конъюгированного с красителем Alexa Fluor, перед введением общей анестезии.

Поместите рыбу в аквариумную воду с раствором MS 2 22 в концентрации 300 mg/L, иммобилизуйте и электрически подавите активность рыбы, введя 100 µL flail в концентрации 3 mg/mL в дорсальную мускулатуру тела. Затем заполните записывающую камеру аквариумной водой и поместите рыбу брюшной стороной вниз на платформу в центре камеры. После этого подавайте аэрированный раствор MS 2 22 в концентрации 100 mg/L со скоростью 1–2 mL/min, поместив наконечник пипетки в рот рыбы.

Затем зафиксируйте рыбу с помощью закрепленных стержней и воска с обеих сторон тела. Контролируйте состояние здоровья рыбы, проверяя непрерывность кровотока в сосудах глаз и нормальный цвет тела. После этого поверните платформу вокруг вертикальной оси.

Отрегулируйте один конец платформы так, чтобы одна сторона дорсальной поверхности головы рыбы оказалась над водой, в то время как остальная часть тела оставалась погруженной. Поместите небольшой кусочек салфетки Kimwipe на любые незатопленные участки кожи, чтобы предотвратить их высыхание. В данной процедуре нанесите 0,4% лидокаина на открытую поверхность головы с помощью ватной палочки.

Затем с помощью лезвия скальпеля вырежьте прямоугольный фрагмент кожного ткани размером примерно 3 мм на 5 мм для рыбы длиной 6,2 см. Латеральный край прямоугольника должен быть выровнен по центру глаза. Передний край прямоугольника должен находиться непосредственно позади глаза, а медиальный край — непосредственно латеральнее срединной линии.

Затем удалите прямоугольник с помощью пинцета. Вырежьте дополнительный квадрат размером 2,5 мм в передней части мозга, чтобы обнажить череп. Полностью очистите обнаженную поверхность черепа, соскребая излишки тканей лезвием скальпеля.

Затем полностью просушите поверхность с помощью салфетки Kimwipe и потока сжатого воздуха. После этого приклейте металлический штифт к переднемедиальной обнаженной области черепа, используя суперклей. Дождитесь полного высыхания клея.

Используйте стоматологическую бормашину с карбидным шаровидным наконечником диаметром 0,5 мм, чтобы наметить на черепе рыбы размером 6,2 см прямоугольник приблизительно два на четыре миллиметра. После этого вырежьте скальпелем и пинцетом по периметру намеченного прямоугольника. Затем аккуратно снимите часть черепа.

Чтобы обнажить головной мозг, разрежьте как пигментированную твердую мозговую оболочку, так и прозрачную мягкую мозговую оболочку с помощью пружинных ножниц или иглы. Затем удалите разрезанные фрагменты пинцетом, чтобы открыть доступ к переднему и заднему экстралатеральному ядрам. Теперь поместите манипулятор с подготовленной ранее иглой с D-покрытием над целевой областью, содержащей интересующие аксоны.

В нашем случае в заднее латеральное экстрануклеус быстро вводится игла примерно на 25 micrometers в ткань. После диффузии красителя в течение 15-30 секунд извлеките иглу. При необходимости повторите процедуру с использованием новых игл.

Разместите каждую каплю в разных точках, чтобы краситель распределился по всей целевой области. Затем промойте полость от излишков красителя раствором Рингера-Хикмана и подождите не менее двух часов для поглощения и транспорта красителя. Для визуализации интересующих аксонов поместите регистрирующую камеру с рыбой под объектив эпифлуоресцентного микроскопа с вертикальным расположением и фиксированным предметным столиком.

Замените раствор для дыхания на свежую аквариумную воду, поддерживая прежнюю скорость потока. Затем поместите один конец заземляющего провода в открытую полость мозга, а другой конец подключите к заземлению головки регистратора. После этого установите пару регистрирующих электродов рядом с основанием хвоста.

Затем подключите электроды к дифференциальному усилителю и записывающему устройству. Для мониторинга командного импульса электрического органа (EODC) подготовьте схематичный набросок области мозга при малом увеличении, указав основные кровеносные сосуды в качестве ориентиров для определения точного местоположения меченых аксонов. Чтобы сначала подтвердить правильность расположения D, рассмотрите всю ткань при освещении в светлом поле для ориентации.

Затем рассмотрите образец при флуоресцентном освещении. В заднем экстралатеральном ядре должно наблюдаться диффузное мечение. После этого при большом увеличении найдите переднее экстралатеральное ядро, используя сосуды в качестве ориентиров.

Освещайте образец флуоресцентным светом, выискивая меченый аксон в приповерхностном слое, используя боросиликатную стеклянную капиллярную трубку с внешним диаметром 1 мм и внутренним диаметром 0,58 мм с нитью-филаментом. Вытяните регистрирующий электрод с узким стержнем длиной 5 мм и диаметром кончика примерно от 1 до 2,4 µm.

Заполните электрод фильтрованным раствором Рингера-Хикмана. Конечный сопротивление кончика должно находиться в диапазоне от 16 до 155 МОм. Поместите электрод в держатель с портом для подачи давления.

Подключите его к головке, установленной на манипуляторе. Затем подключите головку к усилителю. Устройство аналого-цифрового преобразования (на схеме не показано) соединяет усилитель с компьютером.

После этого подайте избыточное давление 30 millibar в линию электрода. Медленно продвигайте электрод от поверхности ткани в сторону аксона. Когда электрод окажется рядом с аксоном, избыточное давление должно вызвать легкое, но заметное смещение аксона.

Зафиксируйте активность во время подачи тестовых стимулов. Хотя наличие электрического артефакта подтверждает правильность регистрации и стимуляции, потенциалы действия должны отсутствовать. Ослабьте давление электрода и повторите стимуляцию и запись.

Затем создайте легкий вакуум, чтобы аксон переместился внутрь электрода. Повторите стимуляцию и запись. Теперь в ответ на стимуляцию должны появиться потенциалы действия.

Как только станут заметны потенциалы действия, перекройте линию подачи давления. По завершении всех необходимых записей снова переключите воду в резервуаре на дыхательный раствор с MS 222 в концентрации 100 mg/L, чтобы рыба была полностью анестезирована. Перед эвтаназией рыбы в течение как минимум 10 минут не должно обнаруживаться никаких EODC.

Ниже представлены пять репрезентативных записей, демонстрирующих потенциалы действия, вызванные монофазным контрлатеральным положительным поперечным прямоугольным стимулом длительностью 0.1 мс и амплитудой 6 мВ/см; также представлен растровый график, отображающий время возникновения спайков в течение 20 повторений окна записи длительностью 75 мс для того же нейрона, стимулируемого в момент времени ноль стимулами 6 мВ/см. Диапазон длительностей указан справа. Здесь показана кривая настройки зависимости от длительности стимула, которая количественно определяет ответы в виде количества спайков на одно повторение стимула.

После освоения данной методики хирургическое вмешательство и введение красителя могут быть выполнены за один час при условии правильного проведения процедуры, а запись данных можно начать через два-три часа после инъекции красителя. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости тщательного мониторинга состояния здоровья экспериментального животного после завершения манипуляций. Для регистрации активности нейронов в еще более глубоких структурах мозга могут быть использованы другие методы, такие как двухфотонная визуализация.

После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как маркировать и регистрировать ответы отдельных нейронов из идентифицированной популяции нейронов.