Обнаружение бактерий с помощью флуорогенных DNAzymes

Общая цель следующего эксперимента заключается в быстром обнаружении присутствия специфических бактерий, таких как кишечная палочка, с использованием новой гриппогенной генной ДНК, ДНК, Zyme зондов, во-первых, полной генной ДНК. Зонды Zyme генерируются путем лигирования. Затем бактерии культивируют для обогащения числа целевых молекул и из надосадочной жидкости готовят накопленную внеклеточную смесь.

Затем сырую внеклеточную смесь объединяют с зондом ДНК-зима, взаимодействие между зондом ДНК-фермента и молекулами-мишенями приводит к расщеплению зонда, который затем используется флуоресцидами. Взаимодействие флуориметра между зондом и мишенью рассматривается как увеличение относительной флуоресценции. Затем результаты проверяются с помощью анализа электрофореза денатурирующего полиакриламидного геля.

Основное преимущество этой методики перед методами ПЦР или на основе антител заключается в том, что процедура проще и легче в выполнении. Хотя этот метод был разработан с моделью бактерии e. coli, он может быть применен для обнаружения любых других пищевых или внутрибольничных бактериальных патогенов. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что они могут не привыкнуть к работе с синтетическими зондами ДНК и бактериями Демонстрируют процедуру Серхио Агуайре, научный сотрудник из моей лаборатории, и Монсо Али, научный сотрудник Для этого протокола.

R-F-D-E-C является рекомендуемой ДНК Zyme. Он состоит из каталитической последовательности EC, подчеркнутой черным цветом, и последовательности субстрата FS, подчеркнутой зеленым цветом, содержащейся в субстрате, представляет собой связь РНК, обозначенную синим r по бокам меченым Fluor обозначенным DT, обозначенным F, и QUENCHER меченный DT, обозначенный очередью RF SS one является зашифрованной версией RFD EEC one, где каталитическая последовательность EEC one частично перемешана в SS one, Но первая часть ФС остается неизменной. RF DEC one и RF SS one получают путем матричного опосредованного ферментативного лигирования олигонуклеотида FS one с олигонуклеотидом EC one или SS one в присутствии LT one в качестве матрицы лигирования для получения сырых внеклеточных смесей или CEMS, которые будут использоваться в качестве мишени для R-F-D-E-C one, начиная с дозирования двух миллилитров LB в стерильные 14-миллилитровые пробирки для культивирования с помощью пистолета-пипетки.

Затем, используя стерильный наконечник для пипетки, выберите одну колонию кишечной палочки из шнековой пластины и опустите ее в культуральную пробирку, содержащую фунт. Поместите пробирки в инкубатор, установленный при температуре 37 градусов Цельсия, и встряхивайте со скоростью 250 об/мин в течение 14 часов после инкубации. Чтобы получить культуру инокуляции 1%, раздайте два миллилитра свежего LB в пробирки для культивирования объемом 14 миллилитров и добавьте 20 микролитров бактериальной культуры с предыдущего этапа.

Инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием со скоростью 250 об/мин до тех пор, пока каждый бактериальный раствор не достигнет наружного диаметра 600 примерно за один перенос. Один миллилитр каждой культуры в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и гранулируйте клетки центрифугированием при 11 000 G в течение пяти минут. После отжима переложите прозрачную надосадочную жидкость в свежую микроцентрифугу объемом 1,5 миллитра

Храните надосадочную жидкость при температуре минус 20 градусов Цельсия. Если он не будет немедленно использован для определения того, генерируется ли флуоресцентный сигнал при взаимодействии ферментов ДНК с экстрактом сырых клеток, образцы анализируют с помощью спектральной фотометрии. Включите флуоресцентный спектрофотометр и настройте параметры сбора данных с возбуждением на 488 нм и излучением на 520 нм.

Также настройте прибор на снятие показаний каждую минуту в течение одного часа. Промойте три кюветы из кристаллов кварца сначала дистиллированной деионизированной водой, а затем 100% этанолом. Высушите кюветы, обдувая газообразным азотом.

Обозначьте кюветы как С 1 для контроля, С два для контроля два и Т для теста далее, переведите 24 микролитра дистиллированной деионизированной воды в С 1 и 24 микролитра приготовленной сырой внеклеточной смеси кишечной палочки в С 2 и Т. Добавьте по 25 микролитров двух X RB к каждому Q vet и поместите их в флуоресцентный спектрофотометр. Начните сбор флуоресцентных данных через пять минут, добавьте один микролитр из пяти микромоляров RFS S один к C два и один микролитр из пяти микромоляров, RFD EEC один к T и C один, следя за тем, чтобы показания флуоресценции не прерывались. Смешайте каждый раствор с помощью пипетирования, затем дайте реакции продолжаться в течение оставшегося периода сбора.

Сохраните данные в формате файла Excel. Затем перенесите данные на персональный компьютер и с помощью Excel создайте графическое изображение. Те же реакционные смеси, которые использовались для анализа компанией Spectra.

Фотометрия может быть использована для анализа методом гель-электрофореза. После одного часа сбора. Извлеките кюветы из спектрофотометра и перенесите растворы в новые микроцентрифужные пробирки.

Угасите реакции, добавив пять микролитров трехмолярного ацетата натрия и 125 микролитров 100% этанола. Перемешайте каждый раствор с помощью вортекса и поместите пробирки в морозильную камеру при температуре минус 20 градусов Цельсия на один час после инкубации центрифуги. Реакцию смеси проводят при 11 000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия и тщательно удаляют надосадочную жидкость с помощью пипетирования.

Высушите гранулы с помощью концентратора ДНК в течение 10 минут. Добавьте 20 микролитров геля в загрузочный буфер и кратковременно вортейтесь. Кратковременно уменьшите вращение с помощью настольной центрифуги.

Затем загрузите 10 микролитров реакционных образцов в лунку 10%-ного геля Dage после запуска. Снимите стеклянные пластины и тщательно промойте их водой из-под крана. Чтобы удалить кусочки геля, протрите пластины салфеткой Кима.

Отсканируйте гелевую пластину на флуоресценцию с помощью сканера тайфуна. Анализируйте полученные изображения с помощью программного обеспечения для количественного анализа изображений для оценки чувствительности системы. Серийно разбавленные культуры выращивают в течение возрастающих временных периодов.

Чтобы определить минимальный инкубационный период, необходимый для обнаружения одной бактерии, подготовьте 10 культуральных пробирок, содержащих два миллилитра фунта, инокулируйте каждую культуру 100 микролитрами двух КОЕ на миллилитр глицеринового запаса кишечной палочки и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 250 об/мин в течение 4, 8, 12, 16 и 24 часов. Соберите 300 микролитров из каждой из инокулированных пробирок с культурами, так как в образцах, собранных во время сбора, может не быть обнаруживаемых бактерий. Баллы 4 8 12.

Дайте оставшейся культуре вырасти в течение 24 часов, чтобы выявить культуры, содержащие бактерии. Измерьте наружный диаметр 600 и осаждайте клетки центрифугированием при 11 000 G в течение пяти минут. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую CEMS, в свежие микроцентрифуги объемом 1,5 мл и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия до использования на следующий день.

Осмотрите культуры на предмет роста. Только одна или две из 10 культур могут содержать кишечную палочку после инокуляции, а остальные пробирки не будут содержать клеток. Для получения реакций расщепления с помощью RFD EEC one анализируйте реакционные смеси с помощью гель-электрофореза DAGE, как описано ранее, оба зонда RFD EEC one и RF SS one были получены путем ферментативного лигирования участков фермента ДНК к субстрату.

Затем методом спектрометрии оценивалось взаимодействие ФС 1 CEM EEC и RFD EEC one или RF SS one. Что видно здесь. R-F-D-E-C один из них выдавал высокий уровень флуоресцентного сигнала при добавлении CEM ec.

В отличие от этого, R FS S one не производил сильного флуоресцентного сигнала. Таким образом, флуоресцентная функция RFD EEC one. При контакте с CEM происходит секвенирование EC.

Специфично для проверки того, что наблюдаемое увеличение флуоресценции было связано с расщеплением связи РНК. Реакционные смеси были проанализированы методом расщепления dage RFD eec, при этом ожидается, что один из 0,25 молярного гидроксида натрия приведет к образованию 2D-фрагментов NA, фрагмент с пятью простыми числами сохранит фтор и третий простой фрагмент с сохранением гасителя. Что видно здесь.

Реакционная смесь RFD EEC CEM EEC действительно дала ожидаемый продукт расщепления. Более того, только UNC расщеплял R-F-D-E-C единицу, и фрагмент с пятью простыми числами мог быть обнаружен с помощью флуоресцентной визуализации. Для изучения специфичности RFD EEC был проведен один флуоресцентный анализ с использованием CEMS, собранного только у нескольких других грамотрицательных и грамположительных бактерий.

Образец, содержащий CEM EC, вызывал увеличение флуоресценции. Отсутствие перекрестной реактивности с CEMS у других бактерий указывает на то, что R-F-D-E-C обладает высокой селективностью в отношении кишечной палочки для определения минимального времени культивирования, необходимого для обнаружения одной клетки кишечной палочки, разведенной до одного КОЕ на миллилитр в 100 микролитрах, культивируемых питательной средой в течение 4, 8, 12, 16 и 24 часов. Полученный CEMS, смешанный с R-F-D-E-C единицей, и расщепление оценивали с помощью dage, как показано здесь.

Изображение анализа Дейджа указывает на то, что R-F-D-E-C не производил ожидаемый продукт расщепления. При реакции с CEM. ECS собирается при четырех и восьми часах роста, что указывает на то, что после освоения требуется время культивирования 12 часов.

Ключевым компонентом этой методики является то, что анализ на основе фермента DA может быть выполнен за 60 минут, если он выполнен правильно После этого развития. Эта процедура открыла путь исследователям в области биоанализа к изучению аллогенных ферментов ДНК для обнаружения широкого спектра бактериальных патогенов.