Микрофлюидных Смесители для изучения сворачивания белков

Общая цель данной процедуры заключается в быстром смешивании двух растворов для запуска биохимической реакции в микросекундном временном масштабе. Это достигается путем предварительного изготовления микрофлюидного смесителя. Вторым этапом является приклеивание чипа к покровному стеклу для герметизации каналов.

Затем чип устанавливается в коллектор, содержащий резервуары с раствором. Заключительный этап представляет собой получение изображений смешанного раствора с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. В итоге биохимическая реакция фиксируется в микросекундном временном масштабе путем преобразования расстояния вдоль выходного канала во время.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как остановленный поток (stop flow), является то, что смешивание не ограничено турбулентностью и происходит за несколько микросекунд. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области фолдинга белков, например, когда происходит гидрофобный коллапс? Процедуру продемонстрирует Лин Ву, постдок моей лаборатории, который начнет изготовление микрофлюидных чипов для смешивания.

Сначала очистите четырехдюймовые FU-кремниевые пластины свежим раствором Пираньи, как описано в письменном протоколе, прилагаемом к данному видео. Затем с помощью печи химического осаждения из газовой фазы при низком давлении нанесите слой поликремния толщиной примерно 1 мкм на каждые предполагаемые 10 мкм глубины итоговых микрофлюидных каналов. После дальнейшей обработки пластин, описанной в тексте, нанесите на них методом центрифугирования слой фоторезиста Z 52 14 толщиной 900 нм, затем проведите мягкий засвет при 90 °C непосредственно на нагревательном столике в течение одной минуты или в печи при 110 °C в течение 30 минут.

После совмещения фотошаблона установите жесткий вакуумный контакт, предварительно подвергнув фоторезист воздействию УФ-излучения в течение нескольких секунд. Затем проявите рисунок в фоторезисте согласно письменному протоколу. Осмотрите структуры на пластине под микроскопом и проведите жесткую выпечку при 115 °C непосредственно на нагревательном планшете в течение двух минут.

Затем проведите очистку от органических загрязнений (DCU) пластин в системе Asher или с помощью кислородной плазмы в течение 2,5 минут при мощности ВЧ-излучения 100 Вт. С помощью установки глубокого реактивного ионного травления полностью удалите слой поликремнезема до достижения подлежащего слоя плавленного кварца. Удалите остатки фоторезиста и обработайте пластину согласно инструкциям в тексте.

Измерьте глубину травления, чтобы убедиться, что полимерное покрытие протравлено насквозь. С помощью установки глубокого реактивного ионного травления, подходящей для оксидов, протравите плавленый кварц на глубину приблизительно 10 мкм на каждый 1 мкм толщины полимерного покрытия. Очистите пластину в матричном асшере (Asher) в течение четырех минут при RF-мощности 100 Вт, затем удалите поликремний с помощью установки травления двухфтористым ксеноном. Перед сверлением отверстий в пластине нанесите методом центрифуганного нанесения новый слой фоторезиста толщиной 1 мкм для защиты каналов при последующих операциях.

Затем закрепите пластину стороной с элементами вниз на жертвенном стеклянном предметном стекле с помощью Aqua Bond 55. Следя за тем, чтобы при склейке не образовывались пузырьки воздуха, используйте компьютерный станок с алмазным сверлом и микро-раствором для очистки 90. Это предотвратит прилипание мелких осколков стекла к каналам, что в противном случае привело бы к засорению чипа во время использования.

Приступайте к сверлению входных и выходных отверстий в каждом чипе. Промойте пластину деионизированной водой, используя шприц для впрыскивания воды в каждое отверстие. Затем, после удаления фоторезиста, выдержите пластину в мыльном растворе в течение одного часа.

Нанесите резист и адгезивы, как описано в тексте. Промойте пластину деионизированной водой и теплым мыльным раствором. После обдува пластины азотом снова промойте каждое отверстие с помощью шприца, избегая попадания на вытравленные элементы.

Продолжайте сушку в вакуумном шкафу при температуре 120 °C. Осмотрите отверстия, чтобы убедиться в отсутствии частиц загрязнений, и при необходимости повторите этапы очистки. Последующие действия следует выполнять в чистом помещении.

Измерьте глубину каналов с помощью оптического или механического профилометра. Очистите пластину, а также покровное стекло из плавленного кварца в чистом помещении, как описано в тексте. Тщательно просушите пластину потоком азота в течение не менее пяти минут.

Затем поместите пластину стороной с элементами вверх на стопку из трех-четырех безворсовых салфеток, которые, в свою очередь, должны лежать на твердой плоской поверхности, например, на небольшом стекле. Повторите те же действия с покровным стеклом. Возьмите покровное стекло за край и переверните его так, чтобы полированная сторона была обращена вниз к пластине.

Аккуратно совместите плоские края, опустите покровное стекло на пластину и дайте ему зафиксироваться, перемещая его только по горизонтали для точной центровки. Надавите одним пальцем на центр пластины. Должно быть видно, как фронт сращивания начинает распространяться к краям.

При необходимости приложите дополнительное давление к другим участкам пластины для продвижения фронта сращивания. После помещения герметизированных пластин в высокотемпературную печь, запрограммированную в соответствии с температурным профилем, указанным в тексте, разрежьте пластину на отдельные чипы с помощью станка для резки пластин. Коллектор для удержания чипа смешивания и растворов может быть изготовлен из пластика, такого как лексан или плексиглас, либо из алюминия.

Для контроля температуры закрепите чип в манифольде с помощью небольших уплотнительных колец и зафиксируйте стопорным кольцом, обеспечивающим беспрепятственный оптический обзор центра чипа. Канавки под уплотнительные кольца должны быть мельче стандартных, чтобы обеспечить плотное прилегание без избыточного давления на чип. После установки чипа добавьте растворы в центральный и боковые резервуары, стараясь удалить все пузырьки воздуха, скопившиеся на дне лунок.

Поместите коллектор на перевернутый микроскоп и изучите область смешивания с помощью окуляра или вывода с камеры. Для достаточного освещения используйте лампу накаливания, расположенную сверху над коллектором. Чтобы визуализировать струю, введите в центральный канал краситель или раствор с высоким показателем преломления.

Поскольку объемы, используемые в этом смесителе, очень малы, поток можно контролировать с помощью давления воздуха, подаваемого над лунками с раствором. Чтобы визуализировать струю, начните с нулевого давления в боковом канале (0 psi) и медленно увеличивайте его до тех пор, пока оно не сравняется с давлением в центральном канале. Если один из боковых каналов засорен, струя будет отклонена к одной из стенок выходного канала.

При появлении видимого засора его можно устранить, создав давление или вакуум в выходном канале с помощью шприца. Если чип засорен белком или другим органическим материалом, его можно очистить, выдержав в растворе «пиранья» в течение ночи. Направьте сфокусированный лазерный луч в исследовательский микроскоп с помощью дихроичного зеркала, расположенного внутри или непосредственно перед микроскопом.

Настройте лазер так, чтобы фокус был виден в окуляре или на камере в области, прилегающей к зоне смешивания. Флуоресценция белка в смесителе собирается объективом, проходит через дихроичное зеркало, фокусируется линзой на диафрагме (пинхоле) и проецируется на счетчик фотонов. Просканируйте чип по осям x и y с помощью пьезоэлектрического сканера для получения изображения зоны смешивания.

Выберите точку на струе и выполните сканирование по осям X и Y, чтобы сфокусироваться в центре канала по вертикали. Глубина резкости микроскопа значительно меньше глубины канала, а скорость потока в канале однородна, за исключением области в пределах одного микрона от стенок. Таким образом, временное разрешение наблюдаемой флуоресценции определяется прежде всего размером конфикального пятна.

Выполните горизонтальное сканирование внутри выходного канала с шагом 100 микрон вдоль струи, осуществляя наблюдение в течение примерно одной миллисекунды в каждой позиции. Переместите предметный столик микроскопа на 80–90 микрон вдоль струи для фиксации более поздних временных интервалов. В качестве альтернативы свет может быть зарегистрирован спектрографом и ПЗС-матрицей после дихроичного зеркала с использованием линзы для фокусировки света на входной щели.

Поскольку сбор данных происходит медленнее, чем при использовании счетчика фотонов, обычно сначала получают изображение струи с помощью счетчика фотонов, а затем измеряют точки вдоль струи с помощью спектрографа. Данные со счетчика фотонов анализируют путем суммирования трех-пяти пикселей вокруг струи в каждой позиции для построения графика зависимости интенсивности от расстояния. Время рассчитывают на основе расстояния, используя расчетную скорость, определенную исходя из приложенного давления.

В качестве заключительного этапа проанализируйте данные спектрографа, используя один из методов, описанных в тексте. Здесь представлен контурный график интенсивности в области смешивания, измеренной счетчиком фотонов. Фоновый сигнал в выходном канале за пределами струи должен быть близок к уровню шума детектора и, как правило, не вычитается.

Более высокий уровень фона может указывать на плохую юстировку или на то, что белок прилипает к стенкам канала. И наоборот, струя, которая выглядит искривленной или заломистой, особенно в области смешивания, свидетельствует о низком качестве травления сопел. Представлен спектр с временным разрешением для белка ACell коэнзим-а-связывающего белка (A CBP), меченого Alexa 4 88 и Alexa 6 47.

Зеленый и красный прямоугольники показывают длины волн, назначенные в качестве донорного и акцепторного каналов соответственно. Из этих данных был вычтен фон для удаления темного тока и лазерного сигнала. Фоновый сигнал был получен при давлении в центральном канале, равном 0 psi.

Время перемешивания можно определить путем измерения быстрой реакции, скорость которой значительно превышает скорость перемешивания, например, тушения флуоресценции триптофана иодидом калия. Поскольку размер струи меньше оптического разрешения микроскопа, в области перемешивания наблюдается значительное падение интенсивности. По мере формирования струи этот инструментальный отклик можно устранить, проведя контрольное измерение без изменения условий раствора.

На данном рисунке представлено соотношение экспериментов с перемешиванием и без перемешивания для флуоресценции N-ацетилтриптофанамида. Линия показывает расчетную концентрацию йодида калия, полученную с помощью многофизического моделирования и симуляций в COMSOL. Время перемешивания, измеренное по времени снижения концентрации на 80%, составляет восемь микросекунд.

На данном графике показаны изменения FRET в белке A CBP после разбавления денатуранта с 6 M до 0,06 M. Эти данные не требуют проведения контрольного эксперимента. Поскольку FRET уже представляет собой отношение, а отклик прибора был исключен, резкий скачок при T, близком к нулю, отражает быстрое изменение сигнала FRET в течение времени смешивания.

После этой разработки данный метод открыл исследователям в области фолдинга белков возможность изучить самые ранние этапы формирования структуры белка.