Создание микробных культур эукариотических обогащения от химически стратифицированных озер Антарктики и оценки углеродного потенциала фиксации
20 апреля 2012 г.
Микробные эукариот являются источником фотосинтеза производные углерода и топ хищных видов в постоянно покрытых льдом озер Антарктиды. В настоящем докладе описывается подход обогащение культуры, чтобы изолировать метаболически универсальный эукариот микробных из Антарктики озера, озера Бонни, и оценивает потенциал неорганических фиксации углерода помощью радиоизотопного анализа для рибулозо-1 ,5-bisphophate карбоксилазы оксигеназы (RUBISCO) деятельности.
Общая цель данной процедуры заключается в получении культур обогащения протистов из антарктического озера Бонни и измерении фиксации углерода в качестве первичного косвенного показателя метаболического разнообразия. Для этого сначала проводится отбор проб воды из озера Бонни на глубинах, соответствующих известным пикам численности протистов и фитопланктона. Затем образцы озерной воды инокулируют в различные питательные среды и инкубируют в ростовой камере, оснащенной регулятором температуры и освещением, в течение четырех-шести недель.
При необходимости культуры можно транспортировать при температуре 4 °C. Следующим этапом является получение сырых клеточных лизатов из обогащенных культур. Заключительным этапом данной процедуры является оценка потенциала фиксации углерода в клеточном лизате с помощью радиоизотопного анализа активности рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (RubisCO).
В конечном счете, культуры пробиотического обогащения демонстрируют вариативность потенциала фиксации углерода в природном сообществе протистов. Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы, касающиеся микробной экологии озер. Например, о роли микробных эукариот в цикле углерода на различных этапах в стратифицированных антарктических озерах.
Хотя отбор проб из толщи воды для последующего получения поколений обогащенных культур является часто используемым методом, данный подход содержит модификации для работы в условиях экстремально низких температур, где могут возникнуть непредвиденные осложнения. Впервые идея этого метода возникла у меня при поиске способов тестирования анализа Redisco на природных образцах озерной воды. Визуальная демонстрация этого метода имеет критическое значение, так как этапы отбора проб трудно представить, поскольку места отбора находятся в среде, непривычной для многих исследователей.
Образцы собирают из озера Бонни, одного из многочисленных постоянно покрытых льдом озер, расположенных в долинах Мак-Мердо в Антарктиде. За один день до отбора проб из толщи воды выберите и подготовьте место отбора. Это позволит стратифицированным слоям толщи воды восстановиться после нарушения, вызванного бурением и плавлением лунки во льду. Определите координаты места бурения с помощью GPS для получения доступа к толще воды.
Начните с бурения отверстия в льду с помощью ледобура Jiffy Ice, оснащенного четырехдюймовым удлинителем Jiffy и режущим венцом для предотвращения примерзания бура в лунке. Старайтесь не бурить в жидкую воду, прекратив процесс примерно на 10–15 см выше верхней границы водяного столба. Для отбора проб диаметр лунки необходимо расширить с 15 см до 60 см.
Это достигается с помощью устройства для плавления отверстий в модели горячего моря, которое прокачивает нагретый полиэтиленгликоль через медную трубку. Процесс плавления обычно занимает до 18 часов и проводится за день до отбора проб из водного столба. Убедитесь, что все необходимое оборудование и сосуды для хранения проб собраны на месте отбора.
Материалы для отбора проб включают бутыль NICU емкостью от 5 до 10 литров, лебедку с калиброванным по глубине тросом, достаточное количество флаконов для проб для каждой глубины отбора, груз-сигнализатор и сумки-холодильники для транспортировки проб. Начните отбор проб рано утром, примерно в 5:00, так как фильтрация озерной воды должна быть завершена в день отбора проб. Используйте пробоотборник Нискина, закрепленный на калиброванной ручной лебедке.
Соберите пробы воды объемом от одного до пяти литров с глубин, необходимых для данного исследования. Глубины отбора проб составляют 6 м, 15 м и 18 м, измеренные от симметричного уровня воды PI в лунке во льду. Храните пробы озерной воды в сумках-холодильниках и транспортируйте их с места отбора в полевую лабораторию.
С помощью саней, прикрепленных к A TV, образцы следует обработать или стабилизировать в полевой лаборатории. Сразу после отбора проб, как только образцы будут доставлены в полевую лабораторию, следует приступить к культивированию обогащенных культур. Концентрируйте от 0.5 до одного литра озерной воды на фильтр диаметром 47 мм с размером пор 0.45 мкм.
фильтры из полиэфирсульфона, используя метод бережной фильтрации. Если требуется оценить разнообразие природного сообщества, профильтруйте второй образец через мембрану диаметром 47 мм с размером пор 0.45 micron.
Фильтры из полиэфирсульфона подвергают мгновенной заморозке в жидком азоте. Каждый фильтр переносят в стерильную пробирку Falcon объемом 50 мл, содержащую около 20 мл фильтрованной озерной воды, отобранной с той же глубины, что и проба для фильтрации.
Перенесите суспензию клеток в стерильную квадратную колбу для культивирования клеток размером 25 сантиметров для обогащения на различных питательных средах. Подготовьте несколько повторностей для каждой глубины отбора проб. Добавьте в каждую колбу по 50 x стерильных растворов следующих питательных сред: Bold's Basal Medium, BG 11 и F/2.
Если требуется культивирование миксотрофных организмов, подготовьте два сосуда с добавками F two и добавьте два-три зерна стерильного риса в одну из колб с культурой; инкубируйте при низкой температуре и пониженной облученности в инкубаторе для выращивания с регулируемым температурным режимом в течение как минимум четырех недель перед отправкой в лабораторию США. Перенесите обогащенные культуры в стерильные пробирки Falcon объемом 50 мл. В запросе на транспортировку укажите требования «не замораживать» и «хранить в прохладном месте». По прибытии в США перенесите 5 мл каждой обогащенной культуры в 45 мл соответствующей питательной среды в колбу объемом 125 мл.
Стерильная колба Эрленмейера закрыта стерильной губкой. При поддержании обогащенных культур в качестве стационарных культур в климатической камере с регулируемой температурой четыре градуса Цельсия и низкой освещенностью переносите культуры на свежую среду каждые 30 дней. Чтобы начать процедуру экстракции клеточного лизата, профильтруйте пять литров обогащенной культуры через 25-миллиметровый фильтр Watman GF/F, используя мягкий вакуум.
Затем разрежьте фильтр на четыре-пять частей стерильными стальными ножницами. После этого с помощью стерильного пинцета перенесите фрагменты в пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 2 мл, заполненную примерно на одну пятую часть раствором с диаметром 0,1 мм.
Силикатно-циркониевые бусины. Добавьте в пробирку 1,25 milliliters буфера для экстракции фильтра, затем проведите разрушение клеток с помощью мини-бидбитера в течение 30 seconds при установке скорости 48, после чего выдержите на льду в течение one minute. Повторите процедуру избиения бусинами еще два раза с одноминутной инкубацией на льду между циклами, чтобы предотвратить нагрев образца в центрифуге.
Центрифугируйте суспензию в течение двух минут при 3000 ×g и температуре 4 °C для образования рыхлого осадка из волокон фильтра GFF и остатков клеточных стенок. Отберите 200 µL осадка и поместите в 800 µL ледяного 90% ацетона.
Перенесите оставшийся супернатант в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Измерьте содержание экстрагируемого хлорофилла А с помощью спектрофотометра при длинах волн 664 нанометров и 647 нанометров. Центрифугируйте оставшийся супернатант в течение двух минут при 15 000 ×g при температуре четырех градусов Цельсия.
Перенесите S в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 milliliter, стараясь не захватить осадок нерастворимых клеточных мембран и остатки волокон фильтра GFF. Полученный растворимый клеточный лизат теперь можно использовать в анализе активности рубискарбоксилазы, который будет продемонстрирован далее. Чтобы начать этот анализ, перенесите 125 microliters каждого растворимого лизата в микроцентрифужную пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 1,5, предварительно охлажденную на льду.
Для образцов отрицательного контроля добавьте 125 µL растворимого лизата в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, не добавляя субстрат. Впоследствии проведите реакции в двух повторностях для всех образцов и отрицательных контролей. Приготовьте 10 мл свежего анализационного буфера и охладите его на льду.
Отмерьте в пробирку объемом 5 мл достаточное количество assay буфера для всех образцов и отрицательных контролей. С этого момента все этапы должны выполняться в вытяжном шкафу. Добавьте в отмеренный буфер бикарбонат натрия, меченный C 14, и держите буфер на льду.
Отоберите 10 µL буфера для анализа, содержащего C 14, и разведите его в одном миллилитре буфера для анализа, перемешивая путем переворачивания. Для смешивания добавьте 100 µL разведенной смеси к трем миллилитрам сцинтилляционного коктейля Bios Safe 2 в сцинтилляционный флакон и переверните для перемешивания. Измерьте количество импульсов C 14 с помощью счетчика Beckman LS 6, 500; перед продолжением анализа количество сцинтилляционных импульсов должно превышать 18 000 имп/мин.
После добавления достаточного количества бикарбоната натрия, меченого C 14, в assay buffer, перенесите реакционные пробирки в сухое термостатное устройство, предварительно нагретое до 25 °C, и инкубируйте в течение трех-пяти минут. Затем добавьте 100 µL assay buffer к лизатам и инкубируйте при 25 °C в течение пяти минут. По истечении пяти минут добавьте рибулозобисфосфат в каждый образец и оставьте реакцию протекать в течение пяти-10 минут при 25 °C.
Для остановки реакции добавьте 100 µL 100% пробиотической кислоты и центрифугируйте в течение одного часа при 2000 ×g для удаления несвязавшегося C 14. Затем перенесите весь объем образцов в сцинтилляционные флаконы, содержащие 3 mL сцинтилляционного коктейля Bios Safe 2, и определите количество импульсов в минуту для кислотоустойчивой фракции.
Конечные продукты определяли методом сцинтилляционного счета. Для выделения новых холодоадаптированных фототрофных и миксотрофных протистов из антарктического озера Бонни с трех глубин использовали метод обогащенного культивирования. Для отбора более разнообразных организмов применяли различные типы питательных сред: среду BG 11, морскую среду, среду Bold's Basal Medium или BBMF 2.
Концентрация питательных веществ и фотосинтетически активная радиация (ФАР), указанные в этой таблице, отражают условия на момент сбора образцов. Визуальный осмотр обогащенных культур с помощью световой микроскопии показал, что в культурах преобладают фототрофные протисты, о чем свидетельствует наличие хлорофилльного пигмента в большинстве клеток. В культурах также наблюдалось разнообразие морфологии клеток в зависимости от глубины отбора проб, с которой был взят инокулят, и типа среды, использованной для культивирования.
Максимальные скорости карбоксилазной активности, катализируемой ферментом rubis, измерялись в обогащенных культурах в качестве косвенного показателя фиксации углерода. Также контролировалось содержание хлорофилла a для оценки биомассы фототрофных протест, как показано здесь.
Несмотря на культивирование всех культур при одной и той же температуре и световом режиме, потенциал фиксации углерода и фототрофная биомасса существенно различались между культурами обогащения. Максимальная активность rubis O наблюдалась в культурах обогащения четыре и шесть, выращенных на среде BBM, а также в культурах обогащения 13 и 14, выращенных на среде BG 11. Напротив, культуры 1921 и 23, обогащенные на питательной среде F two, продемонстрировали максимальную карбоксилазную активность, которая была в 4–34 раза ниже.
Эти различия не были обусловлены более низким уровнем биомассы в двух культурах F, так как активность карбоксилазы была выражена в пересчете на хлорофилл а. Более того, корреляционный анализ Пирсона показал, что активность rubis co не коррелировала с концентрацией хлорофилла а. Культуры BBM были инокулированы озерной водой с глубины шести метров и 15 метров.
В пятом форуме обогащения наблюдался самый высокий уровень хлорофилла А, в то время как во всех остальных культурах уровень хлорофилла а оставался относительно низким независимо от активности фермента rubis. После освоения методы отбора проб из озера занимают около двух часов. В зависимости от количества отобранных проб, анализ карбоксилазы при правильном выполнении также занимает два часа. После данной процедуры могут быть использованы другие методы, такие как анализ гетеротрофной ферментативной активности, для получения ответов на дополнительные вопросы, например, на какой глубине встречаются гетеротрофы. Таким образом, после просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как собирать пробы из озера, обогащать их для получения продукта и проводить анализ активности rubis карбоксилазы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данное исследование посвящено выделению метаболически универсальных микробных эукариот из озера Бонни в Антарктиде. В работе оценивается их потенциал к фиксации неорганического углерода с помощью радиоизотопного анализа активности RubisCO.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробная экология
- Биогеохимия
- Экологическая микробиология
Теоретическая база
- Микробные эукариоты играют важную роль в цикле углерода в экстремальных условиях окружающей среды.
- Озеро Бонни представляет собой постоянно покрытое льдом антарктическое озеро с уникальными микробными сообществами.
- Изучение фиксации углерода у этих организмов позволяет получить представление об их метаболическом разнообразии.
- RubisCO является ключевым ферментом в процессе фиксации углерода.
Цель исследования
- Получение культур обогащения протистов из озера Бонни.
- Измерение фиксации углерода как показателя метаболического разнообразия.
- Оценка потенциала данных культур для дальнейших экологических исследований.
Используемые методы
- Отбор проб озерной воды на глубинах, соответствующих пикам численности протистов и фитопланктона.
- Инокуляция проб воды в различные питательные среды.
- Инкубация в контролируемой камере роста в течение четырех-шести недель.
- Экстракция грубых клеточных лизатов из культур обогащения.
Основные результаты
- Успешное выделение различных микробных эукариот из озера.
- Продемонстрированный потенциал фиксации углерода в клеточных лизатах.
- Предоставление первичных данных о метаболическом разнообразии антарктических микробных сообществ.
- Выявление роли RubisCO в фиксации углерода у этих организмов.
Выводы
- В ходе исследования было успешно проведено обогащение культур микробных эукариот из озера Бонни.
- Потенциал фиксации углерода указывает на значительную метаболическую пластичность.
- Полученные результаты способствуют пониманию роли микроорганизмов в антарктических экосистемах.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет научно-исследовательским группам в области биофармацевтики изолировать и характеризовать метаболически универсальных микробных эукариот из экстремальных сред, создавая релевантную с точки зрения патологий систему для изучения путей фиксации углерода и метаболических адаптаций в условиях стресса. Подход с использованием обогатительных культур способствует валидации мишеней за счет создания масштабируемых и воспроизводимых моделей первичных продуцентов в водных пищевых цепях, что упрощает механистическое снижение рисков при проверке гипотез, связанных с автотрофным и миксотрофным метаболизмом. Путем количественного определения активности RubisCO в качестве косвенного показателя потенциала фиксации углерода данный анализ обеспечивает прогностическую достоверность при скрининге метаболических фенотипов, что помогает в идентификации перспективных ферментов или путей, участвующих в ассимиляции углерода и преобразовании энергии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся механизмов фиксации углерода у эукариот-экстремофилов.
- Практическая ценность: обеспечивает масштабируемый рабочий процесс обогащения для выделения фототрофных и миксотрофных протистов из стратифицированных водных столбов.
- Прогностическая ценность: измерения активности RubisCO служат количественным показателем потенциала фиксации углерода, что способствует снижению рисков при определении метаболического фенотипа.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создание валидированных биологических систем с измеримой карбоксилазной активностью для последующего ферментативного скрининга.
- Практическая ценность: Стандартизированные протоколы лизиса и радиоизотопного анализа обеспечивают воспроизводимость результатов при различных условиях культивирования и типах сред.
- Масштабируемость: Поддержание обогащенных культур в виде стационарных культур позволяет проводить лонгитюдный отбор проб и повторное тестирование в ходе анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: связывает измерения фиксации углерода в окружающей среде с потенциальным поиском биомаркеров в системах с дефицитом питательных веществ.
- Система, релевантная для изучения заболеваний: моделирует метаболическую пластичность в условиях низкого содержания питательных веществ и низкой освещенности, аналогичных ишемическим или гипоксическим микроокружениям.
- Развитие с учетом рисков: позволяет принимать решения о продолжении или прекращении исследований на основе потенциала фиксации углерода в условиях контролируемых стрессоров окружающей среды.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска, обеспечивая воспроизводимый источник эукариотических лизатов для ферментативного профилирования, что позволяет связать отбор проб из окружающей среды с таргетным скринингом при выяснении метаболических путей.
- Открытия в биологии: обеспечивает проверку гипотез о различиях между автотрофным и миксотрофным метаболизмом с помощью контролируемого обогащения и анализов активности.
- Скрининг: позволяет получать стандартизированные лизаты с количественно определяемой активностью RubisCO для профилирования ингибирования или активации фермента.
- Аналитика: радиоизотопный анализ карбоксилазы обеспечивает точные количественные данные для сравнения метаболического потенциала при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывают механизмы адаптации к окружающей среде с консервативными метаболическими узлами эукариот, имеющими значение для патофизиологии человека.
- Практическое применение: рабочий процесс культивирования для обогащения адаптируем к другим экстремальным условиям среды, что позволяет использовать данный подход в качестве платформы для множества исследовательских проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в путях фиксации углерода путем установления связи между обогащением организма и прямым измерением ферментативной активности.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет использования стандартизированных протоколов фильтрации, лизиса и анализа для всех повторностей и временных точек.
- Стратегическая ценность: Помогает в приоритизации портфеля путем выявления высокоактивных культур для дальнейшего глубокого изучения механизмов или проведения омиксных исследований.
- Влияние на портфель: Поддерживает продвижение проектов с учетом рисков за счет количественной оценки метаболической универсальности как признака приспособленности в условиях ограниченного доступа к питательным веществам и свету.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области водной фильтрации, стерильного культивирования клеток и обращения с радиоизотопами для проведения анализов RubisCO.
- Необходимы камеры роста с контролем температуры и регулировкой освещения, а также доступ к оборудованию для сцинтилляционного подсчета.
- Требуется межкомандная стандартизация глубины отбора проб, состава сред и процедур лизиса для обеспечения сопоставимости данных.
- При адаптации метода следует учитывать необходимость модификации состава сред и циклов свет/темнота для различных эукариотических экстремофилов.
- Практические ограничения включают низкий выход биомассы при некоторых условиях культивирования и необходимость нормализации по хлорофиллу a для учета вариабельности фототрофных свойств.
