Высокая пропускная способность физического картирования хромосом использованием автоматизированных На месте Гибридизация

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы сопоставить ДНК-зонды с политановыми хромосомами комара с использованием хромосомного препарата высокого давления с последующей автоматической флуоресцентной гибридизацией в С-2 и автоматизированной визуализацией. Это достигается путем предварительного приготовления спредов политановой хромосомы методом высокого давления. Следующим этапом процедуры является подготовка флуоресцентных зондов путем мечения геномной обратной ДНК флуорохромом с использованием протокола трансляции Ника.

Третьим этапом является проведение флуоресцентной в С-2 гибридизации с использованием автоматизированных систем окрашивания предметным стеклом. Заключительным этапом является сканирование и фотографирование меченых хромосом с помощью автоматической системы флуоресцентной визуализации. В конечном счете, изображения могут показать локализацию флуоресцентно меченого ДНК-зонда на полихромосоме.

Основное преимущество этого метода или существующих методов, таких как стандартный протокол гибридизации in situ, заключается в том, что протокол физического картирования с самой высокой пропускной способностью дает более стабильные результаты и значительно сокращает время работы. Этот протокол начинается с препарирования самок в полувесе и в полувесителе примерно через 25 часов после кормления кровью для сбора их яичников, когда они находятся на третьей стадии Кристофера. На этом этапе прозрачный участок с клетками-медсестрами внутри фолликулов должен иметь круглую форму, собрать яичники у пяти самок и зафиксировать их в 500 микролитрах свежеприготовленного модифицированного автомобильного шумового раствора.

Затем их можно хранить при комнатной температуре до 24 часов или дольше при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Далее, непосредственно перед изготовлением предметных стекол для рассечения яичников, приготовьте автомобильный шумовой раствор и 50% пропионовую кислоту. Поместите каждую пару яичников в каплю свежего раствора автомобильного шума на непыльное предметное стекло под микроскопом для вскрытия.

Разделите яичники с помощью рассекающей иглы. Переложите все части завязи на шесть чистых предметных стекол с 50% пропионовой кислотой. Отделите фолликулы друг от друга с помощью рассекающих игл.

Затем сотрите остатки салфеток бумажным полотенцем. Добавьте еще каплю 50% пропроновой кислоты и подождите три-пять минут. Легенда, фолликулы сидят на 50% пропоновой кислоте в течение трех-пяти минут, что значительно улучшает разброс хромосом.

Далее нанесите покровную накладку и подождите еще минуту, чтобы расправить ядра. Оберните предметное стекло фильтровальной бумагой и полиэтиленом. Установите Dremel в диапазоне от трех до 5 000 об/мин и в течение примерно одной минуты слегка вращайте вращающимся наконечником дремеля по защитному стеклоу.

Подтвердите качество растекания с помощью фазового микроскопа и при необходимости приложите дремель длиннее, чтобы сгладить хромосомы. Поместите второй покровный лист рядом с первым, затем обхватите его другим микроскопом. Затем слайды оберните пластиковым листом и фильтровальной бумагой, поместите слайды в тиски, чтобы сжать слайды до 85-120 дюймов.

После сплющивания хромосом на всех шести предметных стеклах разверните предметные стекла и удалите лишние стекла, чтобы еще больше сгладить хромосомы. Инкубируйте предметные стекла при температуре 55 градусов Цельсия в течение 10-15 минут в системе денатурационной гибридизации предметного стекла. Затем опустите предметное стекло в жидкий азот не менее чем на 15 секунд или до тех пор, пока барботание не прекратится.

Затем быстро снимите крышку колпачка лезвием бритвы и сразу же поместите предметное стекло в холодный, 50% этанол на пять минут. Повторяйте этот процесс для каждого слайда последовательно. Обезвоживайте горки в ванне с 70% и 90% этанолом.

Погружайте их в каждую ванночку на пять минут. Наконец, после того, как горки высохнут на воздухе, они готовы к окрашиванию рыбы. Автоматизированное устройство выполняет большинство этапов процедуры, за исключением маркировки зонда.

Поэтому перед загрузкой устройства подготовьте флуоресцентный зонд, пометив ДНК флуорохромом с использованием коммерческого протокола трансляции NIC с подготовленным зондом, загрузите предметные стекла и реагенты в автоматизированные слайды. Окрашивание системы и программирование системы на выполнение следующих шагов. Сначала подайте 800 микролитров одного XPBS на 20 минут.

Во-вторых, высушите слайды феном. В-третьих, зафиксируйте предметные стекла 450 микролитрами 4%-ного формалина в одном XPBS на одну минуту. Затем промойте горки со 100% этанолом в течение одной секунды, двух и двух минут.

После ванны с этанолом еще раз просушите горки феном. Теперь нагрейте горки при температуре 45 градусов Цельсия в течение двух минут, чтобы избежать образования пузырей. Затем нанесите 20 микролитров ДНК-зонда, после чего каплю минерального масла и покровный слип следующей в природе, хромосомы при температуре 90 градусов Цельсия на 10 минут.

Затем установите предметные стекла на гибридизацию при температуре 42 градуса Цельсия на 14 часов. После затвердевания строгость моет в течение двух минут при температуре 42 градуса Цельсия, после чего следует четыре последовательных односекундных применения двух XSSC и сушка. Затем дважды нанесите 800 микролитров 0,4 XSSC при температуре 42 градуса Цельсия на 10 минут, после чего еще одно умывание и два XSSC при температуре 25 градусов Цельсия на 10 минут.

Теперь нанесите на морилку 50 микролитров йо-йо с последующим минеральным маслом и покройте лоскутками. Инкубируйте предметные стекла при температуре 25 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем снимите крышки крышки.

Вымойте слайды двумя XSSC четыре раза в течение одной секунды за промывку и высушите слайды феном. Наконец, нанесите 15 микролитров пролонгированного золотого реагента против выцветания на каждое предметное стекло и прикрепите новые защитные стекла. Увеличьте мощность автоматизированной системы сканирования Accord plus, начиная с блока питания Olympus U-R-F-L-T для галогенной лампы.

Затем компьютер, и в последнюю очередь микроскоп с насадкой для фотоаппарата. Теперь сначала откройте пакет программного обеспечения duet, настройте предварительное сканирование 10 раз. Нажмите кнопку «Онлайн», введите новый идентификатор дела и назначьте идентификатор слайда.

Нажмите на точку с надписью bf. Это вариант светлого поля. Выберите вариант сканирования до 10-кратного предварительного сканирования.

Выберите 2 круга 500 раз, круг 10 000 x круг или прямоугольник. Нажмите «Установить» и «Запустить». А затем, хорошо, следуйте подсказкам, чтобы правильно настроить сканирование, а затем нажмите «Готово».

Чтобы начать сканирование, нажмите на главную вкладку, чтобы вернуться на главный экран. Теперь нажмите на кнопку офлайн, найдите идентификатор случая и идентификатор слайда, которые были назначены. И нажмите «Офлайн».

Отсканируйте в черном ящике в верхней левой области. Нажмите на стрелку и выберите 10 x предварительное сканирование. Используйте стрелки для просмотра отсканированных изображений после того, как найдете интересующее вас изображение.

Дважды щелкните по экрану в центре целевой области и нажмите кнопку «Привязать». Это приведет к тому, что изображение будет выбрано для захвата позже после выбора всех целей. Щелкните правой кнопкой мыши по каждому изображению, выберите классификацию, выберите 10 x предварительное сканирование и выберите политан.

Вернитесь в главное меню и настройте 40-кратное предварительное сканирование. Снова выберите «Онлайн» и выберите слайд. Измените BF на ffl и измените имя задачи, чтобы вернуться к тире X 40 тире rg.

Измените раздел прямо под последней настройкой, чтобы вернуться к дефисному письму. Затем запустите программу и следуйте подсказкам. Чтобы настроить автоматизацию, нажмите кнопку «Начать сопоставление видов», чтобы сопоставить изображения 10 x и 40 x.

Нажмите «Готово», чтобы начать сканирование. Как только закончите, нажмите «Классифицировать» и посмотрите на изображения. Препараты политановых хромосом клеток яичников-кормилиц из женской аномалии Гамбии были получены с использованием техники высокого давления.

Этот метод не повреждает и не изменяет большую часть структуры хромосомы. Он уплощает изогнутые хромосомы и таким образом выявляет скрытые тонкие полосы, которые не видны на обычных препаратах. Хромосома была зондирована с помощью клонов обратной ДНК, полученных из аномальной библиотеки S Gambia и Tam back.

Библиотека была создана из самца и самки сначала в личинке звездчатки аномального штамма вредителя S Gambia. После этой процедуры может быть выполнено автоматизированное высокопроизводительное физическое картирование, чтобы способствовать быстрому развитию сборок генома на основе хромосом.