Количественный анализ рабочих процессов Фитнес

Целью этой процедуры является параллельный сбор количественных приспособленностей микробной культуры в масштабе всего генома точным и высокопроизводительным способом. Это достигается за счет первого Тьюринга и массивной библиотеки микробных колоний в 96 луночных планшетах и выращивания культуры до насыщения. Далее насыщенные культуры разводят в воде и затем пятнят на твердых агаровых пластинах.

Затем твердые и гарфовые пластины фотографируются периодически и до тех пор, пока рост микробной колонии не будет насыщен. Наконец, фотографии временного хода роста каждой культуры преобразуются в количественные измерения плотности клеток, а наблюдаемые кривые роста с моделями роста и количественными показателями приспособленности микроорганизмов суммируются. В конечном счете, могут быть получены результаты, свидетельствующие о генетических взаимодействиях, демонстрирующие, что штаммы микроорганизмов имеют различную приспособленность либо в сочетании с различными мутациями, либо при выращивании в различных условиях.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как методы закрепления высокой плотности, такие как SGA или эксперименты по соревнованиям по штрих-кодам, заключается в том, что измерения физической формы более точны. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области разработки лекарств от рака, например, какие гены и процессы важны в ответе на повреждение ДНК и контроле клеточного цикла, понимании и переводе таких исследований и основных микроорганизмов в форму потенциальных мишеней для лекарств в раковых клетках человека. Хотя этот метод может дать представление о функции теломер и зрении.

Он также может быть применен к другим областям биологии дрожжей или к любой области, где фенотипы приспособленности могут дать представление о микробной биологии. Мы надеемся, что QFA может быть применена ко многим другим микробным организмам, для которых существуют библиотеки массивов. Например, пови и кишечная палочка, избыток ориллы Начиная с насыщенных за ночь культур играют до 96 самостоятельных штаммов дрожжей в 200 микролитровых объемах богатой жидкой среды.

В 96 хорошо культивируемой чашке простерилизуйте 96 штифт, одну восьмую дюйма диаметра ручной реплики, сначала погрузив ее в 100% этанол, затем обжигая и оставляя остывать массиву, 200 микролитров стерильной воды в лунках 96 луночного планшета пропитайте дрожжевые культуры и разбавьте, опустив стерилизованный штифтовый инструмент в штаммы три раза. Затем, оказавшись в тарелке с водой, простерилизуйте булавочный инструмент и дайте ему остыть, прежде чем трижды погрузить его в разведенные культуры. Затем переложите штифт на твердую агаровую пластину.

После инкубации агаровых пластин используйте роботизированный имидж-сканер S and P SP для ручного отображения их изображений для автоматизированного культивирования. Начните с прямоугольного массива независимых штаммов дрожжей, выращенных на твердом агаре. В этом примере исходные штаммы являются результатом скрещивания чувствительной к температуре мутации запроса с коллекцией делеции дрожжей.

1 536 культур, представляющих четыре реплики 384 независимых штаммов дрожжей, выращивают на планшетах SGA с помощью робота со стерильным инструментом диаметром 96 штифтов в один миллиметр для переноса 384 из 1 536 штаммов в 4 96. Хорошо культуральные планшеты, содержащие 200 микролитров селективной среды, выращивают культуры при температуре 20 градусов Цельсия до насыщения. Чтобы обнаружить насыщенные дрожжевые культуры, начните с переноса их в робот для работы с жидкостью, а Ресуссури подвешивает их на магнитном вибростенде, разбавьте культуры примерно до 1:70 с помощью стерильного роботизированного инструмента на 96 контактов, чтобы влить 200 микролитров стерильной воды.

После очистки и стерилизации штифтового инструмента нанесите разведенные культуры на агаровые пластины. В 384 лунка для переноса планшетов в увлажненный инкубатор с регулируемой температурой и автоматическим карусельным люком и входным люком. Для визуализации культур используется роботизированный автоматизированный тепловизор, который многократно извлекает планшеты из инкубатора, снимает крышки, переносит их в равномерно освещенное пространство под 35-миллиметровой камерой, делает снимок с разрешением 5,184 на 3,456.

Разрешение пикселей заменяет крышку, а затем возвращает их в карусель инкубатора, чтобы отслеживать расположение культур на тарелках и нанесенные на них обработки. На пластины автоматически наносится штрих-код в соответствии с названием инкубатора, температурой, уникальным порядковым номером партии и положением в инкубаторе. Имена изображений представляют собой комбинацию названия номерного знака и временной метки и автоматически генерируются при захвате изображения.

Таблички часто также маркируются вручную, чтобы гарантировать, что они остаются в одном и том же порядке при перемещении между роботизированными каруселями. Файлы метаданных представляют собой текстовые файлы с разделителями табуляции, которые создаются вручную. Файл описания эксперимента FT два.

Таблица 1 уникальна для каждого эксперимента, но описание библиотеки FT 3, таблица 1 может быть широко использована. После создания эксперимент описывается в файле описания эксперимента FT из двух таблиц, одна из которых содержит столбцы для штрих-кода или автоматически сгенерированного названия пластины, метку времени начала эксперимента, обработку пластины, содержимое твердого агарового материала, экранное имя библиотеки, номер библиотечной пластины для библиотек с несколькими пластинами, а также номер повторяющегося квадранта для уменьшения от 1, 536, формат лунки до 384. Ну, формат библиотеки штаммов e описан с помощью файла описания библиотеки FT 3, в таблице 1 указан генотип, выращенный в каждом месте культуры.

В каждой табличке библиотеки она содержит четыре столбца, имя библиотеки, ORF, номерную табличку, столбец строковой таблички и необязательный столбец примечаний. Необязательный файл стандартного названия гена может быть предоставлен FT четыре, таблица 1 с описанием стандартного названия гена, связанного с каждым систематическим номером ORFY, с идентификацией скрининговых штаммов. Этот файл содержит два столбца, ORF и имя гена для анализа данных.

Вычислительный процесс QFA требует доступа к достаточно мощной многоядерной компьютерной рабочей станции, на которой установлено. Программное обеспечение для анализа изображений colonizer и пакет QFAR, оба из которых задокументированы в Интернете, находятся в свободном доступе и работают на различных операционных системах. Запустите colonizer с каждым из захваченных изображений пластин в качестве входных данных, создав один выходной файл colonizer FT пять, таблицу один для каждого захваченного изображения, укажите оценки плотности культуры, культуру, площадь, форму и цвет.

Для каждого из 384 мест на пластине изображения имя выходного файла автоматически копируется из имени исходного файла изображения. Пакет QFAR содержит функции для временных курсов для каждой культуры, чтобы подогнать обобщенные логистические модели популяции к наблюдениям и построить график. Оба см. примеры на рисунках два и три.

Подогнанные значения параметров записываются в файлы логистических параметров QFA. Пакет QFAR также содержит функции для контроля качества. Краевые колонии отбрасываются из-за большей доступности питательных веществ на краях пластин и трудностей с анализом изображений.

Приствольные стенки планшетов и культуры, которые не прошли SGA, и генотипы, демонстрирующие сцепление с генами, специфичными для скрининга, исключаются из анализа. Несколько количественных показателей приспособленности выводятся из параметров логистической популяционной модели для каждой культуры. К ним относятся максимальные показатели удвоения популяции и число делений от инокуляции до насыщения для каждого набора репликируемых культур и для каждого определения приспособленности.

Несколько обобщенных статистических данных об оценках приспособленности представляют собой вычисленные средние и средние показатели приспособленности, стандартное отклонение приспособленности и количество наблюдаемых повторов. Сводная статистика выводится в сводные файлы по физической подготовке QFA FT eight, таблица одна для дальнейшего анализа. Например, расчеты генетического взаимодействия оценивают FT девять таблица один.

На этом рисунке показана одна типичная кривая роста в логарифмическом масштабе OUTTA 384 QFA. Культуры, растущие при температуре 20 градусов Цельсия на твердом агаре, количественно определенном колонизатором, с увеличением плотности клеток, впервые обнаруживаемым примерно через два дня. Эта задержка, вероятно, является комбинированным эффектом фазы задержки культивирования после инокуляции на твердую среду и более низкого предела обнаружения плотности клеток.

Здесь 308 похожих кривых роста были захвачены с одной пластины. Обратите внимание, что штаммы, которые давали плоскую линию, были очень больными или мертвыми. На этом рисунке показано сравнение двух полногеномных скринингов QFA для вывода о силе генетического взаимодействия.

Пакет QFAR также включает функции для получения предыдущего рисунка кривой роста и вывода ранжированных списков исследованных генотипов и оценок силы генетического взаимодействия. Вместе со значением Q, определяющим значимость наблюдаемой ГИС, Once освоила полный полногеномный четырехреплицирующий QF. Эксперимент может быть завершен в течение трех недель. Выполняя эту процедуру, важно помнить о необходимости быть организованным в отслеживании и присвоении имен всем номерным знакам и изображениям.

Все пластины должны быть привиты и затоплены в правильной ориентации и упорядочены дальше. Анализ данных опирается на корректность вспомогательных текстовых файлов, построенных ученым-экспериментатором. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как оценить приспособленность тысяч независимых микробных культур.

Приспособленность оценивается путем многократного фотографирования пятнистых культур, растущих на твердых агаровых пластинах, преобразования полученных изображений в оценки плотности клеток и построения кривых роста. Математическое моделирование кривых роста позволяет получить количественные оценки приспособленности, которые затем могут быть использованы для вывода функциональных отношений между продуктами генов в масштабе всего генома.