Мыши Модель внутрипросветного MCAO: церебральный Оценка инфаркта на Cresyl Окрашивание Фиолетовый
6 ноября 2012 г.
Внутрипросветного средней мозговой модель прикуса у мышей здесь представлены. Объем инфаркта головного мозга оценивается неврологический результат и крезиловый окрашивания фиолетовый, альтернативные окрашивания TTC, предлагая большое преимущество для проверки параллельно многих маркеров интерес.
Общая цель данной процедуры — имитация ишемического инсульта у мышей. Сначала общая сонная артерия временно перевязывается, в то время как наружная сонная артерия перевязывается постоянно как можно более дистально. Еще одна временная, слегка затянутая лигатура накладывается на наружную сонную артерию выше места бифуркации.
На втором этапе внутреннюю сонную артерию зажимают пинцетом с обратным действием, чтобы предотвратить кровотечение. Затем наружную сонную артерию (ECA) пересекают между постоянной и временной лигатурами. После этого в ECA вводят монофиламент с силиконовым покрытием.
Затем наружную сонную артерию (ECA) инвертируют, чтобы ввести монофиламент в внутреннюю сонную артерию (ICA) до достижения основания средней мозговой артерии. Через один час кровоток восстанавливают путем извлечения монофиламента, чтобы имитировать восстановление кровотока после лизиса тромбоэмболического сгустка у людей. В конечном итоге неврологический дефицит, отражающий успех процедуры T-M-C-A-O и степень тяжести инфаркта, может быть оценен сразу после реперфузии, а также через определенные промежутки времени после нее.
Программное обеспечение Cyan Image от NIH используется для расчета объема инфаркта на репрезентативных срезах мозга, окрашенных кристаллическим фиолетовым. Одним из основных преимуществ транзиторной окклюзии средней мозговой артерии с использованием метода внутрипросветного филамента является то, что она имитирует ишемический инсульт у пациентов с последующим восстановлением кровотока; применение данной процедуры на мышах позволяет использовать инструменты генетического маркирования для определения роли целевого белка. Транзиторная окклюзия средней мозговой артерии проводится на самцах мышей линии C 57 black six в возрасте двух-трех месяцев с массой тела от 22 до 28 грамм.
Данный протокол был одобрен Комитетом по биоэтике IRCM для повышения воспроизводимости объема инфаркта. Мы используем многоразовые силиконовые мононити длиной 12 мм и диаметром 60 мкм от корпорации Doco. За два часа до операции.
Введите мыши внутрибрюшинно бупренорфин в дозе 0.03 milligrams per kilogram. Для начала процедуры анестезируйте мышей 5% isof fluorine и поддерживайте анестезию на уровне 2.5% ISO fluorine; используйте heating pad для поддержания постоянной температуры тела мыши во время операции, продезинфицируйте кожу мыши 70% ethanol или Betadine. Затем сделайте разрез по средней линии шеи и раздвиньте мягкие ткани под стереомикроскопом.
Выполните тупой разрез в области шеи мыши, чтобы обнажить трахею. Затем раздвиньте мышцы, чтобы найти сонную артерию. Осторожно выделите левую общую сонную артерию из окружающих тканей.
Наложите временный шов шелковой нитью 5-0, разрезанной на сегменты по 20 мм, вокруг артерии. Будьте осторожны, чтобы не повредить блуждающий нерв. Затем разделите бифуркацию левой внутренней общей сонной артерии (ICA) и наружной общей сонной артерии (ECA) и наложите постоянный шов вокруг ECA как можно более дистально.
Затем наложите еще один временный шов на ECA выше бифуркации. После этого пережмите левую ICA с помощью зажима с обратным действием, чтобы предотвратить кровотечение. Снова будьте очень осторожны, чтобы не повредить блуждающий нерв.
Сделайте небольшое отверстие в наружной сонной артерии (ECA) перед ее разделением на ECA и внутреннюю сонную артерию (ICA), в промежутке между ранее наложенными постоянным и временным швами. Затем введите в ECA 12-миллиметровую монофиламентную шовную нить из силиконизированного полимера размера 6-0, полностью перережьте ECA и переведите монофиламент в ICA. Плотно завяжите узел, чтобы предотвратить кровотечение, и извлеките пинцет с обратным действием.
Затем введите монофиламент в круг Виллиса до тех пор, пока он не перекроет основание средней мозговой артерии (MCA). Его следует ввести примерно на 9–10 мм дальше бифуркации наружной сонной артерии (ECA) и общей сонной артерии (CCA). Как правило, движение монофиламента прекращается, когда он упирается в препятствие.
Будьте осторожны, чтобы не повредить artery palatina palatina. Плотно завяжите шов на ECA, чтобы зафиксировать нить в нужном положении. Теперь закройте кожу с помощью системы автоматического закрытия ран auto clip.
Подкожно введите один миллилитр физиологического раствора и поместите мышей под инфракрасную грелку на период после окклюзии, который составляет 60 минут. Повторно проведите анестезию мышей, затем снимите автоматические зажимы и слегка приоткройте шов на внешней сонной артерии (ECA), чтобы мононить могла выйти, а кровоток восстановился. После этого окончательно завяжите временный шов на ECA, чтобы предотвратить кровопотерю.
Через один час после инсульта извлеките монофиламент и сохраните его для повторного использования. Затем удалите временный шов на общей сонной артерии (CCA), чтобы восстановить кровоток. Зашейте рану и подкожный слой.
Введите мышам еще 1 мл физиологического раствора. Убедившись, что животное восстановило подвижность, поместите его обратно в клетку, расположив половину клетки на грелке, чтобы мыши могли сами выбирать среду обитания. Через 12 часов после операции всем мышам в группе ложнооперированных вводится повторная доза бупренорфина.
Все процедуры идентичны, за исключением того, что после операции мононить не вводится. Неврологический дефицит оценивается для подтверждения успешности T-M-C-A-O и определения показателя эффективности; неврологический дефицит у мышей оценивается через 1, 24, 48 и 72 часа после перфузии по шестибалльной шкале следующим образом: ноль соответствует норме, единица — легкому повороту с или без непоследовательного скручивания при поднятии за хвост. Более 50% попыток скручивания в противоположную сторону.
Два соответствует умеренному стабильному сворачиванию в более чем 50% попыток сворачивания в контралатеральную сторону. Три соответствует стабильному, сильному и немедленному сворачиванию. Мышь удерживает свернутое положение более одной-двух секунд.
Нос почти касается хвоста. Четыре балла соответствуют сильному изгибу. При переходе в состояние «бочкообразности» наблюдается утрата рефлекса ходьбы или написания; пять баллов соответствуют коматозному состоянию или полной неподвижности.
После перфузии раствором PBS быстро заморозьте мозг в изопентане и храните его при температуре -80 °C. Обратите внимание, что, в зависимости от планируемых иммуногистохимических исследований, мозг мыши также может быть перфузирован 4% параформальдегидом. Затем с помощью криостата выполните корональные срезы мозга толщиной 17 мкм, используя 30 предметных стекол.
Поместите один срез через каждые 30 на один предметное стекло. Затем окрасьте первое и пятнадцатое стекла кристаллическим фиолетовым. Для более точной оценки объема повреждения используйте систему анализа изображений, такую как Scion image от NIH, чтобы оценить площадь поражения — область инфаркта, которая выглядит белой в левом и правом полушариях мозга.
Повторите данное ограничение D для всех срезов мозга. Рассчитайте объем инфаркта в произвольных единицах и выразите его в процентах от площади соответствующей области в контралатеральном полушарии без поражений для каждого среза. Остальные стекла храните при температуре -80 °C для проведения иммуногистохимических исследований.
Оценка неврологического дефицита подтверждает успешность проведения T-M-C-A-O у мышей, подвергнутых интралюминальной процедуре. Как видно здесь, наблюдается стабильное сильное или умеренное сворачивание, при этом мышь удерживает свернутую позу более одного-двух секунд, а ее нос почти достигает хвоста. В нашем эксперименте у всех мышей наблюдалось как минимум легкое стабильное сворачивание, что соответствует неврологическому баллу два на протяжении всего периода тестирования.
Окрашивание фиолетовым крессилом было проведено для оценки степени инфаркта головного мозга. После T-M-C-A-O здесь представлены репрезентативные корональные срезы мозга мыши, окрашенные фиолетовым крессилом через 72 часа после реперфузии. Область инфаркта, в основном стриатум, кора и прилегающие области мозга, которые отмечены на снимке, выглядит белой, так как она не окрашивается крессилом.
Фиолетовым цветом здесь показан объем повреждения, который представляет собой белую область правого полушария, выраженную в процентах от площади неповрежденного контрлатерального левого полушария. Объем инфаркта у самцов мышей линии C 57 black six после ишемического инсульта составляет около 70% от объема неповрежденного полушария. Данная процедура обеспечивает высокую воспроизводимость повреждения.
После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как индуцировать транзиторный ишемический инсульт у мышей. Кроме того, подход с использованием метода окклюзии средней мозговой артерии для измерения объема инфаркта мозга дает вам значительное преимущество, предоставляя большое количество материала для анализа соответствующих маркеров методом иммунохимии. Спасибо за просмотр и удачи в вашем эксперименте.
Обзор
В данной статье представлена модель интралюминального окклюзии средней мозговой артерии у мышей — метод имитации ишемического инсульта. Оценка церебрального инфаркта проводится с помощью неврологической шкалы и окрашивания крезиловым фиолетовым, что позволяет проводить параллельное тестирование различных маркеров.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Исследование инсульта
- Модели на животных
Теоретические основы
- Модель транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (T-MCAO) имитирует ишемический инсульт.
- Она позволяет изучать неврологический дефицит и объем инфаркта.
- Эта модель особенно полезна для генетических исследований на мышах.
- Методы оценки включают неврологический скоринг и методы окрашивания тканей мозга.
Цель исследования
- Создать надежную модель ишемического инсульта у мышей для проведения исследований.
- Оценить неврологические исходы после реперфузии.
- Обеспечить возможность использования генетических инструментов для изучения белков-мишеней при инсульте.
Используемые методы
- Временное перевязывание общей сонной артерии и постоянное перевязывание наружной сонной артерии.
- Введение монофиламента с силиконовым покрытием для окклюзии внутренней сонной артерии.
- Восстановление кровотока путем удаления монофиламента через один час.
- Оценка неврологического дефицита по шестибалльной шкале в разные моменты времени после реперфузии.
Основные результаты
- Модель успешно имитирует ишемический инсульт с последующим восстановлением кровотока.
- Неврологический дефицит оценивали и подсчитывали баллы через определенные интервалы времени.
- Окрашивание крезиловым фиолетовым позволило количественно определить объем инфаркта.
- Процедура продемонстрировала воспроизводимость при измерении объема инфаркта.
Выводы
- Метод интралюминальной нити эффективен для изучения ишемического инсульта у мышей.
- Данная модель позволяет исследовать генетические факторы, влияющие на исходы инсульта.
- Будущие исследования могут использовать эту модель для изучения терапевтических вмешательств.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Интралюминальная модель MCAO у мышей позволяет снизить риски при разработке терапевтических средств для лечения инсульта, предоставляя воспроизводимую и генетически доступную систему для оценки объема инфаркта и неврологических исходов. Это способствует валидации мишеней и разработке анализов в доклинических исследованиях инсульта, особенно для методов терапии, направленных на реперфузию или нейропротекцию. Окрашивание крезиловым фиолетовым облегчает параллельный иммуногистохимический анализ, повышая достоверность прогнозов при идентификации перспективных соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы в релевантной модели заболевания, имитирующей эмболический инсульт у человека.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет стандартизированной количественной оценки инфаркта и неврологического анализа.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени, позволяя использовать генетические манипуляции для оценки функции белков при патологии инсульта.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Окрашивание крезиловым фиолетовым позволяет количественно оценить площадь инфаркта для анализа эффективности соединений.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизацию анализа за счет воспроизводимого выражения объема инфаркта в процентах от объема контралатерального полушария.
- Масштабируемость: Совместимо с иммуногистохимическим анализом для мультиплексного скрининга биомаркеров на фиксированных срезах тканей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирует патофизиологию тромботического/эмболического инсульта с реперфузией, что соответствует клиническим сценариям лечения tPA.
- Практическая ценность: Позволяет проводить лонгитюдную оценку неврологического дефицита через 1, 24, 48 и 72 часа после реперфузии.
- Трансляционная преемственность: Облегчает принятие решений о дальнейшем продвижении проекта с учетом рисков путем установления связи между объемом инфаркта и функциональными исходами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель вписывается в континуум процесса разработки лекарств — от валидации мишени и идентификации ведущего соединения до доклинических испытаний эффективности, что особенно актуально для терапии инсульта, требующей уменьшения объема инфаркта и улучшения неврологического статуса.
- Биологические исследования: способствуют уточнению путей передачи сигналов и валидации мишеней с помощью генетических инструментов на клинически значимой модели ишемического повреждения.
- Скрининг: позволяют проводить количественную оценку инфаркта с использованием анализа изображений срезов, окрашенных крезиловым фиолетовым, для скрининга соединений.
- Аналитика: выражение объема инфаркта в процентах от площади контрлатеральной неповрежденной области позволяет проводить перекрестные и лонгитюдные сравнения.
- Трансляционные исследования: схема реперфузии имитирует клинический тромболизис, что обеспечивает преемственность между доклиническими и клиническими исследованиями.
- Корпоративное использование: стандартизированный протокол окрашивания и использование монофиламента с силиконовым покрытием позволяют повторно применять метод в рамках нескольких кампаний по валидации мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая достоверность роли мишени благодаря воспроизводимому инфаркту и неврологической оценке.
- Практическая ценность: Стандартизированная хирургическая техника и окрашивание снижают вариабельность измерений объема инфаркта.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать решения о продолжении или прекращении исследований («go/no-go») на основе уменьшения зоны инфаркта и улучшения неврологического статуса в исследованиях генетических или фармакологических вмешательств.
- Влияние на портфель проектов: Приоритизация мишеней для терапии инсульта с учетом рисков, используя валидированный объем инфаркта в качестве ключевого биомаркера эффективности.
Особенности реализации
- Опыт в области микрохирургической диссекции сосудов и методов окклюзии.
- Доступ к стереомикроскопу, монофиламентам с силиконовым покрытием и криостату для изготовления срезов.
- Стандартизация продолжительности окклюзии, времени реперфузии и протокола окрашивания для всех операторов.
- Учет особенностей адаптации для разных линий мышей, их возраста или пола при изучении вариабельности инфаркта.
- Практическое ограничение: оценка инфаркта требует терминального сбора тканей, что ограничивает возможность проведения лонгитюдной визуализации in vivo.
