Коллекция протокол для поджелудочной железы человека

Общая цель данной процедуры заключается в препарировании поджелудочной железы человека таким образом, чтобы сохранить анатомическую ориентацию органа. Для этого из поджелудочной железы удаляют двенадцатиперстную кишку и селезенку, после чего очищают железу от излишков жировой ткани и сосудов. На втором этапе переднюю поверхность окрашивают синими чернилами, а заднюю — черными.

Затем поджелудочную железу разделяют на три области. Каждую область нарезают поперечно на равные пластины и помещают в парафиновые кассеты, формы для OCT или измельчают далее и помещают в пробирки. В итоге образцы собирают из всех трех областей поджелудочной железы, сохраняя правильную анатомическую ориентацию для последующего анализа.

Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов исследования сахарного диабета 1-го типа, таких как механизмы, лежащие в основе потери массы или функции бета-клеток, а также характер атаки иммунных клеток. Визуальная демонстрация метода обработки поджелудочной железы имеет решающее значение, поскольку сохранение ориентации органа in vivo требует пристального внимания к деталям. Процедуру продемонстрируют Линда Снайдер, гистотехнолог, и Эмили Монтгомери, биолог из моей лаборатории.

Начните с подготовки всех материалов, необходимых для процедуры. Сначала промаркируйте кассеты для парафиновых блоков, указав идентификатор донора, тип образца, номер аликвоты и любую дополнительную информацию. Затем аналогично промаркируйте формы для OCT.

Отрежьте достаточное количество кусочков алюминиевой фольги, чтобы обернуть каждый блок OCT, и отложите их для последующего использования. Подготовьте все пробирки, необходимые для хранения свежих и замороженных образцов. При необходимости добавьте реагент RNA later и среду RPMI.

Затем подготовьте рабочие зоны: разместите препаровальные доски, стерильные инструменты и все остальные расходные материалы, необходимые для процедуры, как в боксе биологической безопасности, так и на столешнице. Расположите все кассеты и формы для OCT-заливки в порядке использования в пределах досягаемости. Приготовьте охлаждающую баню, добавив достаточное количество изопентана, чтобы покрыть сухой лед на дне пенопластового контейнера.

Для начала диссекции удалите двенадцатиперстную кишку и селезенку. Начните отделять двенадцатиперстную кишку от поджелудочной железы с одного конца и продолжайте до полного отделения. Селезенка прикреплена слабо и легко удаляется из жировой ткани и от поджелудочной железы.

Затем очистите поджелудочную железу от постороннего жира, сосудов и нервов, используя сочетание тупой и острой диссекции. Отложите жир и лимфатические узлы для последующей обработки. После очистки поместите поджелудочную железу на препарировочную доску, застеленную бумажными полотенцами.

Поддержание правильной ориентации поджелудочной железы является самым сложным аспектом данной процедуры. Для обеспечения успеха переднюю и заднюю поверхности окрашивают чернилами разных цветов. Окуните аппликатор с ватным наконечником в синие чернила, распределите их по передней поверхности поджелудочной железы и промокните излишки.

Затем окуните новый аппликатор в черные чернила и нанесите их на заднюю поверхность поджелудочной железы. Верните поджелудочную железу в исходное положение. Теперь, когда передняя поверхность обращена вверх, поджелудочную железу можно разрезать на три секции.

Сначала сделайте разрез в месте соединения головки и тела. Затем разделите оставшуюся часть на примерно равные сегменты, чтобы отделить тело и хвост, и зафиксируйте вес каждого отдела поджелудочной железы. Начните с анализа головки.

Разделите каждую область на секции размером примерно 0.5 сантиметра, выполняя поперечные разрезы, подобно нарезке буханки хлеба. После того как все области поджелудочной железы будут разрезаны, извлеките последний срез области головки, представляющий собой участок перехода головки в тело, и поместите его на отдельную препаровальную доску. Измельчите этот участок на мелкие кусочки и равномерно распределите их между маркированными криопробирками с RNA и без RNA.

Затем пробирки замораживают, следуя стандартным процедурам. Повторите эту процедуру для участка соединения тела и хвоста.

После сбора измельченных образцов наклоните все поперечные срезы вправо. Будут удалены чередующиеся срезы каждого региона. Для блоков в парафине и OCT удалите первый срез для парафинизации.

Если фрагмент слишком велик, разрежьте его пополам. Маркируйте кассеты как A и B. Если фрагмент все еще слишком велик, разрежьте каждую часть перпендикулярно предыдущему разрезу, а затем промаркируйте кассеты от A до D по часовой стрелке. Как показано здесь, расположите кассету так, чтобы метка находилась слева.

Затем поместите ткань в кассету и закройте крышку. Перенесите кассету в контейнер с нейтральным буферизованным формалином. Пронумеруйте блоки последовательно внутри каждой области, начиная с самого медиального среза для блоков OCT.

Налейте тонкий слой среды OCT в предварительно маркированную форму. Перед помещением ткани покройте образец средой OCT и быстро заморозьте его для последующего использования, вернувшись к ткани, отложенной ранее. Выделите лимфатические узлы поджелудочной железы, удалив жировую и соединительную ткани, окружающие капсулу узла. Поместите узлы в стерильную чашку с DMEF; крупные узлы измельчите на фрагменты размером не более 0,5 сантиметров.

После выделения поджелудочных лимфатических узлов распределите ткань по подготовленным пробиркам и кассетам для дальнейшей обработки. После работы с лимфатическими узлами селезенку измельчают и хранят аналогичным образом. Для обработки двенадцатиперстной кишки используйте смоченную марлевую салфетку, чтобы очистить слизистую от слизи, затем срежьте слизистую оболочку и разрежьте ее на фрагменты.

Разделите образцы слизистой оболочки, как было показано ранее. С помощью этой процедуры собирают репрезентативные образцы из каждой области поджелудочной железы, как видно здесь. Вес образцов из головки, тела и хвоста был примерно одинаковым.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как обрабатывать поджелудочную железу человека для получения различных типов образцов, в частности, о том, как сохранить ее ориентацию, а также о том, как изолировать лимфатические узлы из перипанкреатической жировой ткани.