Коллекция протокол для поджелудочной железы человека

Общая цель этой процедуры заключается в рассечении поджелудочной железы человека таким образом, чтобы сохранить анатомическую ориентацию. Это достигается путем удаления двенадцатиперстной кишки и селезенки из поджелудочной железы, а затем удаления лишнего жира и сосудов из поджелудочной железы. Второй шаг – покрасить переднюю поверхность синими чернилами, а заднюю – черными чернилами.

Далее поджелудочная железа делится на три области. Затем каждый регион нарезается крест-накрест на ровные плиты и помещается на парафиновые кассеты, формы OCT или измельчается и помещается в флаконы. В конечном счете, образцы собираются из всех трех областей поджелудочной железы, при этом правильная анатомическая ориентация сохраняется для будущего анализа.

Этот метод может помочь решить ключевые вопросы в исследованиях диабета первого типа, такие как механизмы, лежащие в основе потери массы или функции бета-клеток, а также характер атаки иммунных клеток. Визуальная демонстрация метода обработки поджелудочной железы имеет решающее значение, поскольку сохранение ориентации поджелудочной железы in vivo требует внимания к деталям. Демонстрировать процедуру будут Линда Снайдер, гистотехнолог, и Эмили Монтгомери, ученый-биолог в моей лаборатории.

Начните с подготовки всех материалов, необходимых для процедуры. Во-первых, пометьте кассеты, в которых будут храниться парафиновые блоки, с идентификатором донора, типом образца, номером аликвоты и любой дополнительной информацией. Затем промаркируйте формы OCT таким же образом.

Отрежьте достаточное количество кусочков алюминиевой фольги, чтобы обернуть каждый блок OCT, и отложите их для использования позже. Подготовьте все флаконы, необходимые для хранения свежих и замороженных образцов. Добавьте РНК позже и среду RPMI, когда это необходимо.

Затем подготовьте рабочие зоны, разместите доски для вскрытия, стерилизованные инструменты и все другие принадлежности, необходимые для процедуры, как в колпак биобезопасности, так и на столешницу. Разложите все кассеты и формы OCT в порядке использования. Близлежащий. Создайте замораживающую ванну, добавив достаточное количество изопа пентана, чтобы покрыть сухой лед на дне пенопластовой коробки.

Чтобы начать рассечение, удалите двенадцатиперстную кишку и селезенку. Начните разделять двенадцатиперстную кишку и поджелудочную железу с одного конца, и продолжайте до полного отсоединения. Селезенка прикреплена неплотно и легко удаляется из жира и поджелудочной железы.

Далее очистите поджелудочную железу от посторонних жировых сосудов и нервов с помощью комбинации тупого и резкого рассечения. Отложите в сторону жировые и лимфатические узлы, которые будут обработаны позже. После очистки поместите поджелудочную железу на препарирующую доску, накрытую бумажными полотенцами.

Поддержание правильной ориентации поджелудочной железы является самым сложным аспектом этой процедуры. Чтобы обеспечить успех, передняя и задняя поверхности окрашиваются чернилами разного цвета. Обмакните ватный аппликатор в синие чернила, распределите чернила по передней поверхности поджелудочной железы и промокните излишки.

Далее обмакните новый аппликатор в черные чернила и распределите его по задней поверхности поджелудочной железы. Верните поджелудочную железу в нормальное положение. Теперь, когда передняя поверхность обращена вверх, поджелудочная железа готова к разрезанию на три части.

Во-первых, разрежьте место соединения между головой и телом. Далее разделите оставшуюся часть на примерно равные части, чтобы отделить тело и хвост, запишите вес каждой области поджелудочной железы. Начиная с головной части.

Разделите каждый регион примерно на участки по 0,5 сантиметра, разрезая поперечным способом, подобно тому, как разрезают буханку хлеба. После того, как каждая область поджелудочной железы будет разрезана, удалите последний участок области головы, который является участком соединения головы и тела, и поместите его на отдельную доску для препарирования. Измельчите этот участок на мелкие кусочки и равномерно разделите кусочки между мечеными криопробирками с РНК и без нее.

Позже флаконы замораживают. Следуя стандартным процедурам. Повторите эту процедуру для участка хвостового соединения кузова.

После того, как образцы фарша будут собраны, наклоните все поперечные срезы вправо. Чередующиеся участки каждого региона будут удалены. Для парафиновых и ОКТ-блоков удалите первую секцию для парафиновой блокировки.

Если секция слишком большая, разрежьте ее пополам. Обозначьте кассеты буквами A и B. Если деталь все еще слишком велика, разрежьте каждую секцию перпендикулярно предыдущему разрезу, а затем обозначьте кассеты от A до D по часовой стрелке. Как показано на рисунке, расположите кассету так, чтобы этикетка была слева.

Далее поместите салфетку в кассету и закройте крышкой. Переложите кассету в контейнер с нейтральным буферизованным формином. Пронумеруйте блок последовательно в пределах каждой области, начиная с самого среднего участка для ОКТ-блокад.

Залейте тонкий слой ОКТ-среды в предварительно маркированную форму Перед введением ткани накройте ткань ОКТ-средой и быстро заморозьте образец для последующего использования, вернувшись к ткани, которая была отложена ранее. Изолируйте лимфатические узлы поджелудочной железы, обрезав жир и соединительную ткань, окружающую капсулу узла. Поместите узлы в стерильную посуду, содержащую DMEF, пропустите через мясорубку крупные узлы на кусочки размером не более 0,5 сантиметра.

После того, как лимфатические узлы поджелудочной железы изолированы, разделите ткань между подготовленными флаконами и кассетами для дальнейшей обработки. После окончания работы с лимфатическими узлами селезенку измельчают и хранят аналогичным образом. Чтобы обработать двенадцатиперстную кишку, с помощью увлажненной марлевой салфетки протрите слизистую от слизи, отрежьте слизистую, а затем разрежьте ее на части.

Разделите образцы слизистой оболочки, как показано ранее. С помощью этой процедуры собираются репрезентативные образцы из каждой области поджелудочной железы, как показано ниже. Вес головы, туловища и хвостовой части был примерно равным.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как перерабатывать поджелудочную железу человека в различные типы образцов, в частности о способности сохранять ориентацию, а также о том, как изолировать лимфатические узлы от перипанкреатического жира.