Выделение и характеристика дендритных клеток и макрофагов из кишечника мыши

Общая цель этой процедуры заключается в быстрой изоляции кишечных дендритных клеток мышей или ДК и макрофагов для фенотипической и функциональной характеристики. Это достигается путем предварительного забора кишечной ткани. Вторым этапом является диссоциация кишечного эпителия от собственной Ламина.

Затем кишечная Lamin Propria переваривается на заключительных этапах процедуры. Собственные клетки Lamin окрашиваются флуоресценцией, конъюгированными антителами и стробируются для определенных клеточных популяций. В конечном счете, кишечные популяции ДК и макрофагов могут быть более точно охарактеризованы и очищены для функциональных исследований с целью оценки антигена продукции цитокинов и регуляции иммунных клеток.

Таким образом, основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что быстрота переваривания тканей обеспечивает оптимальную экспрессию антигена на клеточной поверхности, жизнеспособность клеток и/или клеточности. После усыпления мыши и подтверждения смерти по рефлексу защемления пальцев ног, тестовый распылитель 70% этанола на брюшную полость и грудную клетку животного. Затем с помощью ножниц сделайте небольшой горизонтальный разрез в середине живота и снимите кожу, чтобы обнажить брюшину.

Откройте брюшину с помощью ножниц после разрезания сфинктера пило, чтобы отделить желудок от верхней части тонкой кишки, и с помощью щипцов удалите брыжейку. Снова разрежьте у илеоцекального клапана, чтобы освободить всю тонкую кишку от толстой кишки. Продолжайте дразнить брыжейку от толстого кишечника и сделайте надрез на анальной грани.

С помощью ножниц разрежьте толстую кишку в продольном направлении и используйте C-M-F-P-B-S комнатной температуры, чтобы вымыть каловое содержимое и слизь из просвета кишечника. Затем с помощью ножниц и щипцов для макроскопии. Рассеките участки костра вдоль противобрыжеечной поверхности тонкой кишки и разрежьте тонкую кишку в продольном направлении.

Затем очистите просвет тонкого кишечника от калового содержимого и слизи с помощью более комнатной температуры C-M-F-P-B-S. Отдельно разрежьте тонкую и толстую кишки примерно на 1,5 сантиметра и поместите кусочки в отдельные 50-миллилитровые конические трубки, содержащие 30 миллилитров довоенного C-M-F-H-B-S-S с FBS и двумя миллимолярами ЭДТА. Поместите каждую 50-миллилитровую коническую трубку горизонтально в орбитальный вибростенд, встряхивая пробирки со скоростью 250 об/мин в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем поместите сетчатое сетчатое фильтр над ведром для мусора. Вылейте содержимое каждой 50-миллилитровой конической пробирки через сетку, чтобы извлечь кусочки кишечника, а затем поместите их в новые индивидуальные 50-миллилитровые конические пробирки, содержащие 30 миллилитров предварительного подогрева C-M-F-H-B-S-S с FBS с двумя миллимолярами ЭДТА. Наконец, поместите трубки обратно в орбитальный шейкер еще на 20 минут.

После второго раунда встряхивания вылейте содержимое каждой трубки через ситечко. Снова промокните излишки среды бумажным полотенцем, а затем переложите кусочки кишки в маленькую пластиковую лодку для сыворотки. Самым сложным аспектом этой техники является переваривание тканей для обеспечения успеха, все различные параметры продолжительности пищеварения, свойства коллагеназы, целостность тканей и размер ткани, подлежащей перевариванию, должны быть учтены при быстром использовании ножниц.

Нарежьте кусочки кишечника, а затем добавьте измельченный кишечник в 50-миллиметровую коническую трубку, содержащую 20 миллилитров раствора коллагеназы. Поместите коническую трубку горизонтально в орбитальный шейкер и переваривайте кусочки кишечника при 200 оборотах в минуту в течение 10-20 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Теперь кратковременно сделайте вихрь в трубке, чтобы обеспечить полную диссоциацию любой оставшейся кишечной ткани, а затем отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр размером 100 микрон непосредственно в коническую трубку объемом 50 миллилитров.

Наконец, наполните коническую трубку C-M-F-H-B-S-S с FBS и центрифугируйте раствор клетки два раза в течение пяти минут при 425 умноженных на G при четырех градусах Цельсия. Затем слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в ледяной C-M-F-H-B-S-S с FBS и поместите образцы на лед. После окрашивания клеток на поверхность представляют интерес белки.

Начните с создания точечной диаграммы, исключающей клетки, которые являются положительными на окрашивание мертвых клеток, как показано здесь. Затем исключите события дублета, как показано здесь и здесь. Теперь используйте передний и боковой каналы рассеивания, чтобы затворить интересующие клетки, стараясь исключить мусор.

Затем создайте еще одну точечную диаграмму, стробирующую на CD 45 положительном и IAB положительном антигене. Представление клеток в виде отдельной точечной диаграммы создает области для различения конкретных подмножеств DC и макрофагов. Показанная здесь область R one захватывает CD 11 C положительные CD 11 B тусклые негативные клетки.

Вторая область R обозначает клетки, которые имеют сходный уровень поверхностной экспрессии CD 11 C, что и клетки в области R one, но которые также экспрессируют CD 11 B. Три области R обозначают клетки, которые являются CD 11, B-положительными и CD 11 C тускло-отрицательными. Эти три области могут быть дополнительно проанализированы на предмет экспрессии F, 4, 80 и CD 1, 0, 3 для дифференциации популяций макрофагов и DC соответственно. Как видно на этой точечной диаграмме, CD 11 C положительные CD 11 B тусклые негативные клетки в области R one будут экспрессировать высокие уровни альфа ein CD 1 0 3 и низкие уровни F 4 80.

Эта точечная диаграмма показывает, что CD 11 B положительные CD 11 C положительные клетки в области R two будут состоять как из DCS, так и из макрофагов на основе их дихотомической экспрессии CD 1, 0, 3 и F, 4, 80. Наконец, основываясь на их F 4 80 положительном и CD 1 0 3 отрицательном фенотипическом профиле R 3, закрытые CD 11 B положительные CD 11 C del отрицательные клетки будут состоять из макрофагов, взаимосвязь между продолжительностью переваривания в тканях на общий выход клеток и экспрессией CD 11 B и CD 11 C проиллюстрирована на следующих шести рисунках. Кишечная ткань, которая переваривается в течение трех минут, дает низкое общее количество клеток, что приводит к небольшому количеству ДК и макрофагов, доступных для характеристики Переваривание в ткани в течение 11 минут производит устойчивый выход живых клеток, образуя популяции ДК и макрофагов, которые экспрессируют высокие уровни CD 11 B и CD 11 C, которые фенотипически различаются.

Напротив, переваривание в течение 50 минут приводит к аналогичному выходу клеток по сравнению с оптимизированным пищеварением. Однако разграничение различных клеточных популяций с помощью CD 11 B и CD 11 C становится более сложным. По мере того, как экспрессия CD 11 С уменьшается, а количество мертвых клеток увеличивается.

Таким образом, оптимизировав параметры переваривания в кишечной ткани, можно быстро достичь надежного выхода клеток. В результате, быстрая изоляция ДК и макрофагов кишечника мышей может быть полезна для оценки функциональных свойств иммунных клеток с интактными поверхностными антигенами.