Выделение и характеристика дендритных клеток и макрофагов из кишечника мыши

Общая цель данной процедуры заключается в быстром выделении дендритных клеток (DCs) и макрофагов кишечника мыши для их фенотипической и функциональной характеристики. Это достигается путем первоначального забора тканей кишечника, после чего следует второй этап — отделение эпителия кишечника от собственной пластинки слизистой оболочки (lamina propria).

Затем, на заключительных этапах процедуры, проводится переваривание собственной пластинки слизистой оболочки кишечника. Клетки собственной пластинки окрашивают с помощью флуоресцентно-конъюгированных антител и проводят гейтирование для выделения специфических популяций клеток. В конечном итоге это позволяет более точно охарактеризовать и очистить популяции дендритных клеток и макрофагов кишечника для функциональных исследований по оценке продукции цитокинов, презентации антигена и регуляции иммунных клеток.

Таким образом, основным преимуществом данной методики перед существующими методами является то, что высокая скорость переваривания тканей обеспечивает оптимальную экспрессию поверхностных антигенов клеток, жизнеспособность и функциональное состояние клеток. После эвтаназии мыши и подтверждения смерти по рефлексу щипка пальца, распылите 70% ethanol на брюшную полость и грудную клетку животного. Затем с помощью ножниц сделайте небольшой горизонтальный разрез посередине живота и отгните кожу, чтобы обнажить брюшину.

Вскройте брюшину с помощью ножниц, предварительно сделав разрез в области пилорического сфинктера, чтобы отделить желудок от верхнего отдела тонкого кишечника, и используя пинцет, аккуратно отделите брыжейку. Сделайте еще один разрез в области илеоцекального клапана, чтобы полностью отделить тонкий кишечник от толстого. Продолжайте отделять брыжейку от толстого кишечника и сделайте разрез в области анального отверстия.

С помощью ножниц разрежьте ободочную кишку вдоль и используйте раствор C-M-F-P-B-S комнатной температуры, чтобы вымыть каловые массы и слизь из просвета кишечника. Затем с помощью ножниц и пинцета макроскопически выделите Пейеровы бляшки вдоль антимезентериальной поверхности тонкого кишечника и разрежьте тонкий кишечник вдоль.

Затем очистите просвет тонкого кишечника от каловых масс и слизи, используя дополнительный объем C-M-F-P-B-S комнатной температуры. Отдельно разрежьте тонкий и толстый кишечники на фрагменты длиной примерно 1,5 сантиметра и поместите их в отдельные конические пробирки объемом 50 миллилитров, содержащие 30 миллилитров предварительно нагретого C-M-F-H-B-S-S с FBS и 2 мM EDTA. Поместите каждую коническую пробирку объемом 50 миллилитров горизонтально в орбитальный шейкер и перемешивайте пробирки при 250 об/мин в течение 20 минут при 37 °C.

Затем поместите одну сетчатую колбу-фильтр над приемным ведром для отходов. Пропустите содержимое каждой конической пробирки объемом 50 миллилитров через сетку, чтобы собрать фрагменты кишечника, а затем поместите их в новые индивидуальные конические пробирки объемом 50 миллилитров, содержащие 30 миллилитров предварительно подогретого Prewarm C-M-F-H-B-S-S с FBS и двумя миллимолярными EDTA. Наконец, верните пробирки в орбитальный шейкер еще на 20 минут.

После второго цикла встряхивания перелейте содержимое каждой пробирки через сито. Снова промокните излишки среды бумажным полотенцем, а затем перенесите фрагменты кишечника в небольшой пластиковый лоток. Самым сложным аспектом данной методики является переваривание ткани; для обеспечения успеха необходимо учитывать все параметры: продолжительность переваривания, свойства коллагеназы, целостность ткани и размер фрагментов, которые следует быстро измельчить с помощью ножниц.

Измельчите фрагменты кишечника, затем перенесите измельченный кишечник в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 20 мл раствора коллагеназы. Поместите коническую пробирку горизонтально в орбитальный шейкер и подвергните фрагменты кишечника воздействию фермента при 200 RPM в течение 10–20 минут при 37 °C. После этого подвергните пробирку кратковременному воздействию вортекса для обеспечения полной диссоциации any оставшихся тканей кишечника, а затем профильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр с размером пор 100 мкм непосредственно в коническую пробирку объемом 50 мл.

Наконец, долейте в коническую пробирку C-M-F-H-B-S-S с FBS и центрифугируйте клеточную суспензию дважды по пять минут при 425 ×g при температуре четырех градусов Цельсия. Затем слейте супернатант, ресуспендируйте клеточный осадок в ледяном C-M-F-H-B-S-S с FBS и поместите образцы на лед. После этого проведите окрашивание клеток на интересующие поверхностные белки.

Начните с создания диаграммы рассеяния (dot plot), исключив клетки, окрашенные красителем для мертвых клеток, как показано здесь. Затем исключите события двойных клеток (дуплеты), как показано здесь и здесь. Теперь используйте каналы прямого и бокового светорассеяния для выделения интересующих клеток, стараясь исключить клеточный дебрис.

Затем создайте другой точечный график (dot plot), используя гейтирование по антигенам CD 45-положительным и IAB-положительным антигенпрезентирующим клеткам. На отдельном точечном графике создайте области для различения конкретных подмножеств дендритных клеток и макрофагов. Область R1, показанная здесь, охватывает CD 11 C-положительные и CD 11 B-слабоотрицательные клетки.

Область R two определяет клетки, имеющие такой же уровень поверхностной экспрессии CD 11 C, как и клетки в области R one, но также экспрессирующие CD 11 B. Области R three обозначают клетки, которые являются CD 11 B-положительными и CD 11 C-слабоотрицательными. Эти три области могут быть подвергнуты дальнейшему анализу на экспрессию F4/80 и CD 103 для дифференциации популяций макрофагов и дендритных клеток соответственно. Как видно на данном точечном графике, CD 11 C-положительные и CD 11 B-слабоотрицательные клетки в области R one будут экспрессировать высокие уровни α-eCD 103 и низкие уровни F4/80.

На этой точечной диаграмме видно, что клетки CD 11 B положительные CD 11 C положительные в области R two будут состоять как из DCS, так и из макрофагов, исходя из их дихотомической экспрессии CD 1 0 3 и F four 80. Наконец, основываясь на их фенотипическом профиле F four 80 положительные и CD 1 0 3 отрицательные, в области R three клетки CD 11 B положительные CD 11 C del отрицательные будут состоять из макрофагов; зависимость между продолжительностью переваривания ткани, общим выходом клеток и экспрессией CD 11 B и CD 11 C проиллюстрирована на следующих шести рисунках. Ткань кишечника, перевариваемая в течение трех минут, дает низкое общее количество клеток, в результате чего для характеристики доступно мало DCS и макрофагов; переваривание ткани в течение 11 минут обеспечивает высокий выход живых клеток, позволяя получить популяции DCS и макрофагов, которые экспрессируют высокие уровни CD 11 B и CD 11 C и являются фенотипически различными.

Напротив, переваривание в течение 50 минут приводит к выходу клеток, схожему с показателем при оптимизированном переваривании. Однако дифференциация различных популяций клеток с использованием CD 11 B и CD 11 C становится более затруднительной, поскольку экспрессия CD 11 C снижается, а число погибших клеток увеличивается.

Таким образом, путем оптимизации параметров переваривания тканей кишечника можно быстро добиться высокого выхода клеток. В результате экспресс-изоляция дендритных клеток и макрофагов кишечника мыши может быть полезна для оценки функциональных свойств иммунных клеток с сохранными поверхностными антигенами.