Wholemount иммуногистохимии для выявления сложной топографии мозга

Общая цель данной процедуры заключается в выявлении сложных паттернов экспрессии генов в структуре целого неповрежденного мозга. Для этого сначала проводят перфузию животного и извлекают мозг. Затем мозжечок препарируют и обрабатывают в соответствии с протоколом окрашивания целого препарата.

Заключительным этапом является визуализация экспрессии генов с помощью гистохимической цветной реакции. В конечном итоге для получения изображений паттернов экспрессии генов на поверхности используется микроскопия в светлом поле. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как иммуногистохимия срезов тканей, является возможность визуализации сложных структур в трех измерениях без необходимости реконструкции.

Процедуру демонстрирует Джошуа Уайт, аспирант моей лаборатории. После жертвования животного и извлечения головного мозга из черепа отделите мозжечок от остальной части мозга, сначала введя кончики пинцета в середину верхнего и нижнего мозолистых тел. Затем, используя второй пинцет, медленно отделите мозолистые тела и кору от мозжечка.

Ориентируйте мозжечок так, чтобы его передняя сторона была обращена вниз, а ствол мозга был направлен вверх. Теперь введите пинцет в четвертый желудочек между стволом мозга и листками 9 и 10 мозжечка. Перережьте ножки, сжимая их пинцетом с обеих сторон, а затем осторожно отделите мозжечок от ствола мозга.

Проведите дофиксацию мозжечка путем погружения в 4% паральдегид при температуре 4 °C в течение периода от 24 до 48 часов. Мозжечок может храниться в 4% паральдегиде в течение длительного времени при условии работы в вытяжном шкафу. Осторожно слейте раствор паральдегида и замените его плотным фиксатором.

Поместите пробирку с мозжечком и фиксирующим раствором на шейкер и осторожно перемешивайте в течение шести-восьми часов. По истечении времени инкубации слейте концентрированный фиксатор и замените его концентрированным раствором гипохлорита натрия. Инкубируйте мозжечок в этом растворе в течение ночи при температуре 4 °C, продолжая перемешивание на следующий день.

Замените раствор в пробирке на 100% methanol. Поместите пробирку на мутатор и осторожно встряхивайте при комнатной температуре в течение 30 минут. По истечении времени инкубации замените раствор свежим 100% methanol и повторите инкубацию, чтобы обеспечить дегидратацию мозжечка.

Теперь проведите циклы замораживания-оттаивания ткани в 100% methanol, поместив пробирку в контейнер с сухим льдом и выдержав в замороженном состоянии в течение 30 минут. По истечении этого времени с помощью пинцета извлеките пробирку из сухого льда и оставьте ее на лабораторном столе для оттаивания на 15 минут. Повторите процедуру замораживания-оттаивания не менее четырех раз, чтобы улучшить проникновение окрашивающих растворов.

После окончательного размораживания поместите пробирку в морозильную камеру при температуре -80 °C на ночь. Ткань можно хранить в течение длительного времени при -80 °C как непосредственно перед, так и после этапов замораживания-оттаивания. В противном случае следует продолжить выполнение протокола.

На следующий день. Проведите регидратацию мозжечка путем погружения с перемешиванием в растворах 50% метанола и 50% PBS, затем в 15% метанола и 85% PBS, и далее в 100% PBS по 60–90 минут в каждом при комнатной температуре. Затем, для образцов мозжечка взрослых мышей, подвергните ткань ферментативному расщеплению с использованием протеиназы K в концентрации 10 micrograms per milliliter в PBS в течение двух-трех минут при комнатной температуре с перемешиванием.

Данный этап переваривания не требуется для мозжечка мышей в возрасте пяти недель или моложе. После переваривания немедленно слейте протеиназу K и промойте мозжечок в PB S 3 раза по 10 минут каждый, чтобы предотвратить избыточное переваривание. После финальной промывки замените раствор на P-B-S-M-T и ROCK и выдержите в течение ночи при четырех градусах Цельсия для блокировки ткани на следующий день.

Слейте блокирующий раствор P-B-S-M-T и инкубируйте ткань в растворе первичных антител, разведенных в P-B-S-M-T с добавлением 5% DMSO, в течение 48 часов при температуре четыре градуса Цельсия в режиме осторожного перемешивания (rocking). По истечении времени инкубации промойте мозжечок два-три раза по два-три часа в P-B-S-M-T при температуре четыре градуса Цельсия с перемешиванием для удаления несвязавшихся первичных антител.

Затем инкубируйте ткань с вторичными антителами в растворе P-B-S-M-T с 5% DMSO при температуре четырех градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день, при постоянном перемешивании, промойте мозжечок в P-B-S-M-T, как и ранее. Затем проведите финальную промывку в PBT в течение одного-двух часов при перемешивании и температуре четырех градусов Цельсия.

На этом этапе удаляются излишки молока, что повышает четкость окрашивания. Наконец, инкубируйте ткань в растворе DAB. До достижения оптимальной интенсивности окрашивания раствор DAB рекомендуется использовать в темноте.

Поскольку свет вызывает осаждение хромогена, что может привести к усилению фонового окрашивания, коричневый продукт реакции должен стать отчетливо видимым в течение 10 минут при достижении оптимальной интенсивности окрашивания. Остановите реакцию, перенеся мозжечок в PBS с 0,4% sodium azide.

Ткань можно хранить в этом растворе в течение длительного времени. Окрашенную ткань при целостном монтировании следует визуализировать, погрузив ее в PBS или другую среду, обеспечивающую оптимальный показатель преломления. Чтобы облегчить позиционирование целостного препарата для визуализации, приготовьте 1% агаровый гель в пластической чашке Петри.

Затем прорежьте в геле небольшие отверстия, после чего поместите мозжечок в эти отверстия в нужном для визуализации положении и залейте его PBS. Теперь окрашенная ткань готова к визуализации с помощью световой микроскопии. ZEIN two Adelaide c.

Иммуногистохимический анализ выявляет сагиттальные полосы на поперечных срезах мозжечка. На схеме отмечены лабиалы четыре, пять и три. Для ориентации масштабная линейка соответствует 500 microns.

ZEIN два. Белок С из Аделаиды экспрессируется исключительно в подмножествах тел клеток kinji и дендритах. На данном изображении масштабная линейка соответствует 150 microns.

На данном изображении представлен цельный препарат мозжечка, окрашенный на zein two, Adela C, демонстрирующий полосы клеток Бикини на снимках передней, центральной и задней зон мозжечка. Римские цифры обозначают доли мозжечка. LS — lobulus simplex.

PML означает парамедиальную губную зону. COP обозначает копулятивные параметры и метки. Crust one и crust two — названия двух LOE полусфер; обозначения P one и P three основаны на стандартной номенклатуре, используемой для указания конкретных полос BR two.

Для получения более подробной информации см. Sillitoe и Hawks 2002. Масштабный отрезок соответствует 1 mm. Здесь мозжечок был подвергнут иммуноокрашиванию с использованием антитела к пептиду транскрипта, регулируемого кокаином и амфетамином.

Как видно, данная клетка экспрессируется в подмножествах лазающих волокон, которые проходят через слой клеток Пуркинье (PCL) и заканчиваются в молекулярном слое (ml). Здесь масштабная линейка соответствует 100 microns.

На данном изображении видно, что положительные волокна корзинки проецируются в виде полос дендритов клеток-корзинок в молекулярном слое мозжечковой коры, включая такие области, как Oculus с меткой PFL и Oculus с меткой fl. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости избегать повреждения мозжечка. Любые внешние повреждения затруднят визуализацию сложных паттернов окрашивания.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выявлять сложные и интересные паттерны экспрессии генов в нейронах и в волокнах, контактирующих с ними в неповрежденном мозге.