Одноместный мутагенеза бисульфит ооцитов

Общая цель этой процедуры заключается в анализе метилирования ДНК в одном ооците. Это достигается путем предварительного удаления кумулюсных клеток и мыльной палиты из собранных ооцитов. Вторым шагом является встраивание ооцита в раствор для лизиса в соотношении «два к одному», чтобы защитить мельчайшее количество ДНК от потери или разрушения.

Далее проводится мутагенез бисульфита с последующей амплификацией с помощью вложенной полимеразной цепной реакции. Заключительным этапом является лигирование и клонирование ПЦР-продукта. Затем клоны отбирают, амплифицируют методом ПЦР и отправляют на секвенирование.

В конечном счете, мутагенез и секвенирование бисульфитов используются для демонстрации метилирования ДНК в цитозинфосфатной гвинее или динуклеотидах CPG области, представляющей интерес в одном ооците. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как бисульфитный мутагенез больших количеств клеток, заключается в том, что данные могут быть получены из одного ооцита без объединения цитов, смещения ПЦР и химиоклеточной контаминации. В день сбора ооцитов приготовьте растворы, перечисленные в письменном протоколе, при приготовлении растворов уменьшите вероятность загрязнения ДНК, часто меняя перчатки и используя фильтрующие наконечники, также держите пробирки под углом, когда они открыты, и закрывайте все пробирки, когда они не используются.

Начните сбор OSI с помещения рассеченных мышиных овканалов в М-2 среды и разрыва М-шкива для извлечения комплекса кучевых клеток. Затем отделяют циты от кумулюсного клеточного комплекса с помощью 0,3 миллиграмм на миллилитр раствора гиалуронидазы в 30 микролитре капли М двух сред. Держите циты в растворе только до тех пор, пока не будет удалены кумулюсные клетки, так как длительное воздействие может повредить их.

Промойте ооциты в 30 микролитрах капель М двух сред, перекладывая ооциты из капли в каплю. Периодически удаляйте кумулюсные ячейки в общей сложности три промывки. Удалите букву Z LUCITA с помощью кислого раствора для шин.

Сначала поместите ооциты в одну каплю раствора объемом 30 микролитров, затем переложите в другую каплю на 30 микролитров. Так как любая переносимая с собой среда будет разбавлять кислоту и снижать ее эффективность. Держите циты в растворе только до тех пор, пока требуется для удаления зон, так как длительное воздействие может повредить их.

После удаления зоны снова промыть циты в капле М 30 микролитров в двух средах, выполнить агрос, заложив сначала раствор лизиса на нагревательный блок при температуре 70 градусов Цельсия. Добавьте предварительно нагретый раствор с низкой температурой плавления или LMP Agros в раствор для лизиса, получив два к одному раствор AGROS для лизиса. Затем поместите одну яйцеклетку на чистое предметное стекло в минимальной М-двух средах.

Следующим шагом является встраивание одного цита в раствор Агроса и лизиса. Сделать это нужно быстро, так как агрос будет закаляться при температуре ниже 65 градусов по Цельсию. Наберите 10 микролитров лизисного раствора Агрос в наконечник пипетки под микроскопом.

Аккуратно выдавите около одного микролитра или меньше раствора для лизиса агроса на предметное стекло, позволяя ему смешаться с минимальным количеством среды. Аккуратно поднимите ооцит в наконечник пипетки. Затем поместите все 10 микролитров в трубку эйнора с 300 микролитрами минерального масла так, чтобы полученная бусина приобрела сферическую форму.

Инкубируйте трубку на льду в течение 10 минут, чтобы выполнить лизис. Удалите 300 микролитров минерального масла и добавьте 500 микролитров буфера для лизиса SDS. Инкубируйте образец в течение ночи на водяной бане, установленной на 50 градусов Цельсия на вторые сутки.

Приготовьте растворы для мутагенеза бисульфида в свежем виде, как описано в письменном протоколе. Начните мутагенез с полного удаления 500 микролитров буфера для лизиса SDS. Имейте в виду, что любой оставшийся буфер для лизиса будет разбавлять агрос при нагревании, и бусина будет более восприимчива к растворению на последующих этапах.

После полного удаления буфера лизиса добавьте 300 микролитров минерального масла. Инкубируйте образец в течение двух с половиной минут на термоблоке с температурой 90 градусов Цельсия. Возьмите карат, чтобы перемешать или перемешать, продлить или колебать температуру.

Через две с половиной минуты. Инкубируйте образец на льду в течение 10 минут. Чтобы провести денатурацию, удалите минеральное масло и добавьте в трубку один миллилитр 0,1 моляра гидроксида натрия и переверните трубку пять-шесть раз.

Инкубируйте образец в течение 15 минут. На водяной бане, установленной на 37 градусов Цельсия, переворачиваясь каждые три-четыре минуты, шарик должен плавать в гидроксиде натрия. Обратите внимание, что бусина больше не находится на дне трубки.

Для выполнения сульфитной обработки сначала аккуратно поверните трубку после удаления гидроксида натрия. Добавьте 300 микролитров минерального масла и 500 микролитров раствора сульфита BIS. Следите за тем, чтобы не попадать на свет, и инкубируйте трубку в течение трех с половиной часов на водяной бане при температуре 50 градусов Цельсия.

Теперь выполните дезинацию. Сначала инкубируйте образец на льду в течение трех минут, прежде чем удалить минеральное масло и раствор сульфита BIS. После легкого отжима добавьте один миллилитр 0,3 молярного гидроксида натрия и переверните трубку пять-шесть раз.

Инкубируйте образец в течение 15 минут. На водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия, переворачивающейся каждые три-четыре минуты, шарик должен плавать в гидроксиде натрия до начала ПЦР. Промойте образцы, сначала аккуратно отжима.

Затем удалите гидроксид натрия и добавьте один миллилитр одного xte pH 7,5. Встряхивайте от пяти до 10 минут при комнатной температуре. После второго легкого отжима снимите один XTE.

Повторите этот процесс стирки дважды. Затем добавьте один миллилитр автоклава, дважды дистиллированной воды. Встряхните от пяти до 10 минут при комнатной температуре, слегка открутите в третий раз и удалите воду.

Дважды повторите промывку двойной дистиллированной водой. Наконец, удалите всю надосадочную жидкость, оставив только бусину aros. Убедитесь, что pH надосадочной жидкости равен 5,0.

Если надосадочная жидкость все еще слишком простая, промойте бусины еще раз двойной дистиллированной водой. Тем временем добавьте в пробирку для ПЦР первую круглую смесь для ПЦР, как описано в письменном протоколе. Сдвиньте твердотельную агро скорость к кромке трубки эйнора.

Затем осторожно перенесите агроскорость в ПЦР-пробирку, нагрейте до 70 градусов Цельсия в течение одной минуты и перемешайте, после чего амплиментируйте предлагается в письменном протоколе. После амплификации первого раунда приготовьте реакцию ПЦР второго раунда, используя в качестве шаблона пять микролитров продукта первого раунда. Обязательно нанесите бипа ниже слоя минерального масла.

Приступайте к выполнению второго раунда усиления, как указано в тексте, в качестве диагностического теста. Образцы второго раунда могут быть разрезаны ферментом рестрикции, то есть метилированием, или специфическим электрофорезом для деформации продуктов пищеварения на 8%-ном акриламидном геле. Любые полученные гетерогенные полосы представляют собой более чем одну последовательность для клонирования второго круглого продукта в вектор и выполнения клонирования ТА, как описано в рукописи, сопровождающей это видео, после клонирования планшета TA всю реакцию смешивают на агаре и планшете LB, дополненном ампициллином, ex gal и IPTG, и инкубируют планшет при 37 градусах Цельсия в течение ночи.

Затем добавьте мастер-смесь для ПЦР колоний в пробирку для ПЦР, как указано в письменном протоколе. Выберите белую бактериальную колонию с планшета с помощью наконечника для пипетки и вмешайте ее в 35 микролитры мастер-смеси для ПЦР колонии в ПЦР-пробирке. Приступайте к амплификации суспензии, как описано в тексте, после ПЦР-амплификации электрофореза четырех микролитров продукта ПЦР на 1,5%-ном геле АГРОС.

Наконец, отправьте примерно 30 микролитров продукта ПЦР для секвенирования пяти колоний ПЦР на цит. После получения результатов секвенирования можно считать паттерны метилирования любого исходного цитозина гуанина, который остался в таком виде метилированным. И наоборот, любой исходный цитозин гуанин, который теперь является тиаминовым гуанином, был неметилирован после вложенной ПЦР-амплификации с использованием бисульфитных преобразованных праймеров.

Подтвердить успешную конверсию можно, визуализировав правильный размер фрагмента на индивидуальной метафазе геля aros. Два ооцита представляют собой один родительский аллель и теоретически имеют один импринтированный паттерн метилирования. Продукты второго раунда ПЦР могут быть проверены на непреднамеренное загрязнение.

Фермент рестрикции, чувствительный к метилированию ДНК, может быть использован для расщепления продукта ПЦР второго раунда, чтобы оценить, содержит ли он метилированный или неметилированный аллель. При этом происходит расщепление метилированного цитозина в последовательности распознавания фермента. В то время как неметилированный цитозин, который превращается в тимин, больше не распознается ферментом и не разрезается, любой образец ооцита метафазы 2, содержащий как метилированные, так и неметилированные аллели, должен быть отброшен, поскольку это указывает на загрязнение кучевых клеток или включение полярных тел после лигирования и трансформации.

Успешная амплификация ПЦР с колониями может быть визуализирована на геле AROS, чтобы гарантировать, что образцы с правильным размером продукта будут отправлены на секвенирование. В этом примере ожидаемый размер ампликона после лигирования составляет сто 56 пар оснований. Здесь пятый клон имеет неправильный размер ампликона и его не следует отправлять на секвенирование.

Последовательность из пяти отдельных клонов из ооцита метафазы 2 должна производить пять идентичных паттернов метилирования и идентичные скорости конверсии без CPG. Любые сэмплы, содержащие более одного шаблона, должны быть отброшены. Поскольку овулированные метафаза 2 циты имеют две хромосомные копии или прикрепленное полярное тельце, существует возможность получения двух сходных последовательностей.

Данные должны быть отброшены от любых цитатов, которые имеют сильно отличающиеся друг от друга паттерны метилирования. Поскольку нельзя исключать загрязнение кумулюсных клеток При попытке проведения этой процедуры важно помнить, что сначала необходимо несколько раз промыть ооциты в свежей среде, а затем провести обработку HI IDE, чтобы удалить как можно больше кумульных клеток. Во-вторых, агро с низкой температурой плавления будет затвердевать при температуре ниже 65 градусов по Цельсию, поэтому работайте аккуратно, но быстро.

И, наконец, сульфат натрия и гидрохинон чувствительны к свету, поэтому реакционные пробирки и растворы следует заворачивать в фольгу.