Препараты для Лиофилизацию бактерий и их влияние на выживаемость клеток

Целью данного эксперимента является изучение влияния различных составов лиофилизатов на выживаемость клеток. Сначала подготавливают различные составы для лиофилизации клеточных культур. Затем каждый состав смешивают с клеточной культурой, подвергают лиофилизации, после чего проводят регидратацию и измеряют показатели выживаемости.

Результаты демонстрируют различия в показателях выживаемости, которые могут быть связаны с охарактеризованными свойствами. Данный метод поможет определить, какие физические и структурные свойства рецептуры имеют важное значение для выживания клеток в процессе дегидратации. Для приготовления стартовой культуры Pseudomonas putida начните с инокуляции 100 milliliters соевого-триптического бульона (TSB) колонией клеток, культивированных на агаре с добавлением соево-триптического бульона (TSB); инкубируйте культуру при 30 °C, перемешивая при 130 RPM в течение семи часов.

Перенесите аликвоту культуры в свежую среду TSB и культивируйте в течение 16 часов. Соберите клетки путем центрифугирования при 1, 500 ×g в течение 20 минут при комнатной температуре. Промойте клеточный осадок с помощью буфера Resus, ресуспендировав его в 150 мМ хлорида натрия.

Осадите клетки центрифугированием и ресуспендируйте их в среде для формуляции. Подготовьте растворы для формуляции для лиофилизации клеток.

Взвесьте соответствующие компоненты матрицы и растворите их в воде для достижения изотонических условий. Доведите раствор до нужного состояния с помощью вспомогательного вещества, хлорида натрия или других совместимых с клетками растворенных веществ. Чтобы гомогенно ресуспендировать клетки в растворе с низкой вязкостью, подвергните растворы с высокой вязкостью воздействию вортекса.

Добавьте магнитный перемешиватель и встряхните смесь. Затем разлейте составы по предварительно взвешенным флаконам для лиофилизатора и взвесьте флаконы. Отберите по 100 µL из каждого образца и приготовьте десятикратные серийные разведения; высейте необходимые разведения на чашки и инкубируйте их при комнатной температуре. Если флаконы будут герметично закрыты внутри лиофилизатора, закройте каждый флакон с посеянными клетками резиновой пробкой.

Подсчитайте количество клеток в каждой формуляции. С помощью метода кольца Дюну измерьте поверхностное натяжение высушенных бактериальных смесей. Очистите платиновое кольцо, прокалив его в бесцветном пламени до появления красного свечения.

Промойте и протрите измерительный сосуд с помощью ацетона и безворсовой салфетки, затем обжгите внутреннюю поверхность сосуда пламенем. Наполните сосуд раствором и, если для достижения равновесия требуется время, дайте поверхности стабилизироваться перед проведением измерений. Используемая здесь установка позволит получить качественные данные для составов с высокой вязкостью.

Используйте раствор с более низкой концентрацией для измерения поверхностного натяжения и экстраполяции; условия лиофилизации должны быть скорректированы в соответствии с физическими свойствами состава. Наиболее важным параметром является температура стеклования или TG состава, обозначаемая как TG штрих для замороженного концентрированного образца, что указывает на сохраняющееся присутствие воды. Чтобы определить характер замерзания состава, поместите от 5 до 10 мг образца в алюминиевый тигель для дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) с крышкой.

Подготовьте пустую тигельку в качестве эталона. Настройте программу сканирования температуры ДСК так, чтобы она имитировала этап замораживания в программе лиофилизации. Это необходимо, поскольку кинетика охлаждения может повлиять на TG' формуляций, не подвергшихся лиофилизации, до начала сканирования при нагреве.

Снизьте температуру до значения значительно ниже ожидаемой tg. Для исследуемых составов выберите соответствующую скорость нагрева. Регистрируемый сигнал теплового потока выражается в ваттах и будет зависеть от скорости нагрева.

Более высокая скорость нагрева обеспечит более выраженный сигнал TG Prime; установите температурный диапазон таким образом, чтобы он охватывал как TG prime, так и температуру плавления состава. После определения характеристик замерзания скорректируйте параметры процесса лиофилизации так, чтобы температура образца всегда оставалась ниже его TG, а давление в камере обеспечивало бы быструю сублимацию льда и остаточной воды в составе. Это необходимо для защиты сухих продуктов после лиофилизации.

Обеспечьте контроль атмосферы образцов, герметизировав их в лиофилизаторе до сброса вакуума в конце цикла лиофилизации. В качестве альтернативы флаконы можно заполнить подходящим газом. Важно не допускать воздействия условий окружающей среды на образцы, так как любое содержание влаги или кислорода в атмосфере хранения повлияет на выживаемость клеток.

Наконец, взвесьте флаконы для последующего анализа образцов с помощью рентгеновского излучения. Нанесите небольшое количество бактериального матрикса на держатель образца и установите держатель в рентгеновский рефрактометр. Используйте программное обеспечение, совместимое с рентгеновским оборудованием, для анализа любой кристаллической фазы, присутствующей в образце.

Для анализа бактериального матрикса методом электронной микроскопии нанесите небольшое количество образца на углеродную ленту, закрепленную на держателе для сканирующего электронного микроскопа. Поместите держатель СЭМ в установку для напыления и покройте образец золотом и палладием или платиной для последующей визуализации. Установите держатель СЭМ в камеру и выберите соответствующие параметры получения изображения.

Например, на данном приборе мы используем ускоряющее напряжение 5 kV, размер пятна 3, рабочее расстояние 5 mm и детектор вторичных электронов. В этой таблице приведены данные для различных составов, включая термические эффекты, зарегистрированные методом DSC при нагревании замороженных составов, структуру сухих образцов и поверхностное натяжение растворов составов. TG' сахарозы составляет -40 °C, что может затруднить обнаружение концентраций сахарозы ниже 20% w/w.

Тепловой эффект при минус 35 °C, вероятно, связан с началом растворения льда, показанным здесь. Данные о выживаемости грамотрицательных P putter и грамположительных a CHLOROPHYL cus, приготовленных в различных составах на основе сахаридов. Обратите внимание, что тенденция того, насколько эффективно состав поддерживает выживаемость клеток, схожа для обоих видов бактерий.

На этом графике показана корреляция между выживаемостью после лиофилизации и поверхностным натяжением составов, что указывает на то, что более высокое поверхностное натяжение приводит к более высоким показателям выживаемости. Представленные здесь СЭМ-изображения соответствуют сухим составам четырех различных полимеров, матрицы которых выглядят как хрупкая бумага или взаимосвязанные гладкие листы с гофрированным рисунком встроенных бактерий для fi, ccal и сахарозы. Толщина листов составляет около одного микрона, а ширина — от 10 до 20 микрон, при этом fi ccal имеет более гладкую поверхность, а HPMC и HEC образуют гораздо более тонкие листы.

При этом бактерии становятся более заметными, возможно, из-за более низкого соотношения полимера и бактерий в этих составах на основе целлюлозы. Кроме того, для HEC и HPMC наблюдалось образование кристаллов соли, причем в случае с HPMC на поверхности полимерных листов было отмечено большее количество осадка. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выживаемость клеток зависит от свойств состава при использовании продемонстрированных здесь методов.