Преобразование Capture ИФА в Пробирной Luminex Xmap помощью скрининга Мультиплекс антител методом

Общая цель следующего эксперимента заключается в преобразовании предварительно оптимизированного анализа Eliza на цитокин TNF альфа в платформу Xap при одновременной оценке альтернативных пар антител. Это достигается путем связывания антитела захвата из набора ELIZA вместе с тремя другими антителами-кандидатами на захват с четырьмя различными наборами микросфер или шариков при смешивании. Эти четыре набора позволяют одновременно тестировать всех четырех кандидатов с четырьмя отдельными антителами для обнаружения для определения наилучшей пары антител.

Следующие два анализа Xap конструируются с двумя наиболее оптимальными парами антител. Затем производительность анализов сравнивается с производительностью исходного анализа EISA в отношении силы сигнала, динамического диапазона и чувствительности. Результаты показывают, что аналогичные антитела могут работать совершенно по-разному в одних и тех же условиях и что несколько антител могут быть одновременно проверены с помощью анализа Luminex Xap, что показывает, что анализ имеет повышенную чувствительность и динамический диапазон по сравнению с EISA.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как EIS A, заключается в том, что иммунологические анализы на основе xap позволяют исследователю тестировать несколько мишеней или, как в данном случае, тестировать несколько антител одновременно. Для выявления наилучшего антитела продемонстрировано. Проводить процедуру будет Эрика Лопес, младший научный сотрудник корпорации Luminex.

Начните этот протокол с выбора и получения четырех антител захвата и четырех антител обнаружения, специфичных для ФНО альфа человека, как описано в письменном протоколе. Кроме того, приготовьте одно подтверждающее антитело, специфичное для вида-хозяина улавливаемых антител. Доведите реагенты из набора для сопряжения антител до комнатной температуры.

Пометьте четыре реакционные пробирки номерами областей шариков, выбранных для реакции сопряжения. Переложите содержимое четырех флаконов микросфер mag plex в четыре помеченные реакционные пробирки. Промойте каждый из наборов шариков дважды в 500 микролитрах активационного буфера и активируйте каждый набор шариков растворами сульфа ONHS и EDC, как описано в наборе для связывания антител.

Руководство пользователя после 20-минутной инкубации на ротаторе повторите предыдущий этап промывки с активированными шариками в общей сложности три раза с 500 микролитрами активационного буфера. Для каждой стирки приготовьте четыре отдельных раствора по 500 микролитров. Каждый из них содержит 7,5 мкг буфера для инактивации антител захвата.

Добавьте эти четыре раствора антител захвата в соответствующие реакционные пробирки. Сделайте каждую трубку вихрем немедленно и инкубируйте в течение двух часов на ротаторе. Повторите этап промывки с теперь уже парой бусин в общей сложности три раза с 500 микролитрами буфера для промывки, входящего в комплект для соединения антител.

После заключительной стадии промывки добавьте 500 микролитров промывочного буфера в каждую реакционную пробирку, чтобы обеспечить концентрацию в 5 миллионов шариков, связанных антителами, на миллилитр вихря, а затем проведите ультразвуковую обработку реакционных пробирок для диспергирования гранул. Подсчитайте количество бусин, выделенных после реакции связывания, с помощью клеточного счетчика или гемоцитометра. Восстановление после реакции сопряжения обычно составляет более 90%.Подтвердить, что реакция сопряжения была успешной, приготовив тестовые растворы сопряженных бусин для каждого набора с конечной концентрацией 100 гранул на микролитр в буфере для анализа, приготовить разведение меченых антис форм FICO.

Антитела IgG при норме 4 мкг на миллилитр в пробирном буфере аликвоты по 50 мкм каждого исследуемого раствора в четыре лунки круглого дна 96 лунок в общей сложности 16 лунок. Затем добавьте 50 микролитров буфера для анализа в восемь лунок для измерения фона и 50 микролитров разведенного антитела подтверждения в восемь оставшихся лунок. Осторожно перемешайте реакции, несколько раз пипетируя вверх и вниз многоканальным пипетером.

Накройте тарелку крышкой и выдерживайте 30 минут при комнатной температуре на тарелке-шейкере. Поместите пластину на магнитный разделитель пластин на одну-две минуты, чтобы вытащить шарики из раствора. Затем удалите жидкость, с усилием перевернув пластину, находясь на сепараторе над емкостью для отходов.

Промойте каждую лунку дважды, добавив 100 микролитров буфера для анализа и удалив SANE с пластины аналогичным образом. С помощью магнитного пластинчатого сепаратора суспендируйте шарики в 100 микролитрах буфера для анализа, аккуратно пятикратно пипетируя вверх и вниз многоканальным пипетером. Анализируйте на приборе luminex xap, таком как инструмент magix.

Интенсивность флуоресцентного сигнала этой реакции прямо пропорциональна количеству белка на поверхности шариков, что обеспечивает быструю оценку относительного количества белка, связанного с шариками. Чтобы определить наиболее эффективную пару антител в анализе xap, приготовьте исходную смесь из всех четырех наборов шариков, добавив по 10 микролитров каждого из них к 0,96 миллилитров буфера для анализа. Приготовьте растворы антител для обнаружения, разбавив каждое антитело до одного микрограмма на миллилитр в буфере для анализа.

Также пробирный буфер. Приготовьте в системах ФНО альфа-белка стандарта в концентрации 2000 пикограмм на миллилитр и разбавьте стрептавидин R FICO eryn до восьми микрограммов на миллилитр. Добавьте 50 микролитров смеси шариков, связанных антителами, в каждую из 16 лунок 96-луночного планшета CoStar с круглым дном для скринингового анализа.

Затем добавьте 50 микролитров буфера для анализа в восемь из 16 лунок для измерения фона. Затем пипетка вводит 50 микролитров стандарта TNF альфа в остальные восемь лунок для измерения отклика. Инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре, защищенной от света, при этом встряхивая на встряхивателе для пробирного планшета.

Затем добавьте по 50 микролитров каждого из четырех антител обнаружения в четыре лунки, две из которых являются фоновыми лунками, а две из которых — ответными. Инкубировать в течение 30 минут в тех же условиях после добавления 50 микролитров реагента SAPE во все лунки. Снова выдержать в течение 15 минут в тех же условиях.

Поместите пластину на магнитный разделитель пластин на одну минуту. Затем удалите жидкость, с усилием перевернув пластину, находясь на сепараторе над емкостью для отходов. Пипеткой подайте по 100 микролитров буфера для анализа в каждую из 16 лунок.

Затем удалите жидкость из шариков с помощью магнитной сепарации. Далее добавьте по 100 микролитров буфера для анализа в каждую из 16 лунок. Прочтите табличку с прибором Luminex mag picks со ссылкой на инструкцию пользователя для правильной эксплуатации.

Выберите пару антител, которая соответствует желаемой мощности сигнала. После выбора наилучшего антитела для захвата разведите 100 микролитров этого связанного антитела до 10 миллилитров с помощью буфера для анализа. Добавьте 50 микролитров разведенных шариков в 78 лунок двух CoStar с круглым дном 96 луночных пластин

Каждая пластина будет использоваться для оценки эффективности различных антител для обнаружения. Далее подготовьте стандартную кривую из 12 пунктов, начинающуюся с 8 000 пикограмм на миллилитр и заканчивающуюся четырьмя пикограммами на миллилитр. С помощью систем НИОКР.

Стандарт TNF Alpha добавляет шесть 50 микролитровых репликатов каждого разведения в каждый из планшетов, плюс шесть лунок с 50 микролитрами буфера для анализа каждая в качестве фона, что в общей сложности составляет 78 лунок на планшет. Инкубируйте планшеты в течение одного часа при комнатной температуре, защищенной от света, при этом встряхивая на шейкере для пробирных пластин. Затем добавьте 50 микролитров антитела первого обнаружения во все 78 лунок первой пластины.

Повторите для второго обнаружения антител на второй пластине. Инкубируйте пластины в течение 30 минут в тех же условиях. Затем добавьте по 50 микролитров реактива SAPE во все лунки каждой пластины.

Встряхнув две пластины в течение 15 минут в защищенном от света месте, поместите пластины на магнитные разделители пластин на одну минуту. Удалите жидкость, с усилием перевернув пластину, находясь на сепараторе над емкостью для отходов. Далее пипеткой внесите 100 микролитров буфера для анализа в каждую из 78 лунок на планшетах перед тем, как удалить жидкость из магнитных шариков.

После добавления сотни микролитров пробирного буфера в шарики в каждую из 78 лунок на планшетах, проанализируйте пластины на магнитных отмычках прибора, обратившись к руководству пользователя для правильной эксплуатации. Следуя инструкциям, прилагаемым к R&D-системам, human TNF Alpha T NF SF one a DUO set ELI A kit. Измерьте реакцию, полученную в соответствии со стандартом, входящим в комплект для исследований и разработок.

Повторите анализ ELI еще три раза, заменяя антитела для обнаружения и обнаружения систем НИР антителами других поставщиков. Для простоты сопоставьте антитела по поставщикам, оцените каждую пару независимо в соответствии с требованиями формата EISA с каждым из трех стандартов белка TNF Alpha. Анализы Luminex Xap проводили в мультиплексном режиме для оценки всех четырех антител захвата в виде смеси путем объединения четырех наборов антител TNF альфа, связанных с микросферами Mag PLX, антитела захвата оценивали с каждым из четырех биотинилированных антител по отдельности, так что взаимодействие одного антитела обнаружения с каждым из четырех антител захвата можно было определить одновременно.

Результаты показали, что пара антител из набора DUO и R- и D-систем показала наилучшие результаты с результирующим ответом при 6,183 медианной интенсивности флуоресценции или единицах MFI. Также было отмечено, что антитела обнаружения от Millipore и ABAM обеспечивали разумный ответ в анализе XAP в сочетании с антителами захвата систем RD, антитела захвата от Millipore, ACAM и Novus вызывали менее желательный ответ в анализе XAP. Протокол набора DUO для исследований и разработок был использован для сравнения четырех пар антител в формате EISA.

Протокол систем НИОКР использовался со всеми парами антител, поскольку он отражает типичные протоколы ИФА, широко используемые сегодня, и является аналогом протоколов, используемых с технологией xap. Тесты EISA показали, что пара антител из систем R и D снова дала наилучшие результаты. Пара антител от Acam не вызвала ответа, а пары антител от Millipore и Novas дали умеренные ответы, чтобы оценить любые изменения реактивности антител.

В соответствии со стандартом все четыре пары антител были протестированы с использованием трех различных стандартов рекомбинантного альфа-белка TNF от трех разных поставщиков. Данные показывают, что стандарты рекомбинантного альфа-белка TNF от трех поставщиков дали эквивалентные результаты. Альфа-белок TNF из систем НИР и D был использован для построения стандартных кривых с помощью анализов ELSA и XAP.

В то время как анализ ELI A проводился с парой антител системы r и d, в анализе xap использовалось антитело захвата системы r и d и либо антитело обнаружения из систем r и d, либо Millipore. Альфа-белок TNF из систем R и D разбавляли для получения диапазона концентраций от 8000 до 4 пикограмм на миллилитр. Пара антител из систем R и D дала ожидаемый результат в анализе Xap с ответом более 20 000 MFI, как показано.

Когда детектирующее антитело от Millipore использовали с Xap-анализом вместо антитела для обнаружения r и d систем, ответ составил около 30% от ответа, полученного от детектирующего антитела от RD систем. Зеленая линия на этом графике представляет собой стандартную кривую ELA, которая имела рекомендованный производителем диапазон альфа-TNF от 16 до 1000 пикограмм на миллилитр. Из-за ограниченности спектрофотометра увеличить дальность анализа Элизы не удалось.

Кроме того, динамический диапазон и чувствительность обоих методов лучше иллюстрируются при построении графика в логарифмической шкале. Можно увидеть четкое различие между наклоном ответа EISA и ответами xap-анализов, что также указывает на более ограниченную способность к обнаружению TNF альфа с EL iza как в более высоких, так и в более низких концентрациях. Пределы обнаружения или LOD для двух функциональных анализов TNF альфа xap были приближены путем определения самой низкой концентрации TNF альфа с наблюдаемым уровнем ответа, превышающим фоновый, плюс в три раза большее стандартное отклонение или SD от шести повторов.

Здесь можно наблюдать, что при использовании пары систем r и d самая низкая концентрация альфа-TNF на уровне 3,91 пикограмма на миллилитр вызывала отклик в 66 MFI, что больше, чем отклик для фона плюс три SD встречи. Этот критерий. Когда антитела для обнаружения миллипор использовались с антителами для захвата систем НИОКР, предел обнаружения составлял менее 7,81 пикограмм на миллилитр.

В этом случае вторая самая низкая концентрация альфа-ФНО продуцируется в приемлемом ответе на 17 МФИ больше, чем реакция самой низкой концентрации альфа-ФНО плюс трехкратное стандартное отклонение. Аналогичным образом, предел обнаружения для дуэта систем исследований и разработок Eliza был оценен в диапазоне от 63 до 31 пикограмма на миллилитр. После этой процедуры могут быть выполнены другие этапы, такие как тестирование, различные матрицы образцов или концентрации антител в репортере, с целью дальнейшей оптимизации анализа xap.