Автоматизированная количественная оценка Synaptic флуоресценции в

Целью данной процедуры является эффективный количественный анализ размеров и яркости точечных флуоресцентных сигналов в ганглиях. Это позволяет анализировать большие популяции объектов. Статистически визуализируются синаптические белки.

В данной демонстрации первым этапом процедуры является создание синхронизированных культур ELEGANS интересующего вида с высокой плотностью. Затем получают конфокальные изображения меченых синапсов, сводя к минимуму индивидуальную вариабельность изображений. Синаптические пунктуры идентифицируются автоматически и отделяются от фоновой флуоресценции.

Заключительным этапом является табулирование и систематизация данных для эффективного последующего анализа. В конечном итоге результаты позволяют точно показать, как экспериментальные условия влияют на распределение синаптических белков или любого другого белка, локализованного в высококонтрастных пунктирных структурах. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как анализ Z-проекций, является сохранение всех данных, включая объемы синапсов, а автоматическая идентификация позволяет быстро собрать сотни образцов для каждого условия.

Для данного протокола требуются культуры взрослых особей *C. elegans* высокой плотности, выращенные на 10-сантиметровых чашках с пептидным агаром NGM на бактериях *E. coli* штамма NA 22. Подготовьте ровно одну чашку для каждого запланированного иммуногистохимического окрашивания. Начните со сбора червей, используя несколько миллилитров воды. Перенесите их в коническую пробирку объемом 15 мл и повторяйте этот процесс до тех пор, пока большая часть червей не будет собрана.

Осадите червей центрифугированием и промывайте осадок водой до трех раз, пока супернатант не станет прозрачным. Это позволяет удалить остатки бактерий. Всегда переносите растворы, которые могут содержать червей или яйца, с помощью пластиковых пипеток, так как они могут прилипать к стеклу. Теперь крайне важно быстро выполнить оставшиеся этапы, чтобы предотвратить потерю жизнеспособности яиц.

Высвободите яйца червей, подвергнув их повторному изгибу в 5 мл щелочного раствора гипохлорита. Осторожно покачивайте пробирки и проверяйте их под диссекционным микроскопом примерно раз в минуту. Продолжайте процедуру в течение пяти минут или до тех пор, пока примерно половина червей в пробирке не окажется согнутой и разломленной.

Заполните пробирку доверху яичным буфером и несколько раз переверните ее. После осаждения червей аспирируйте и удалите супернатант. Затем трижды промойте осадок яичным буфером.

После промывок Риз суспендирует осадок в пяти миллилитрах воды, затем добавляет пять миллилитров стерильного 60% раствора сахарозы в воде и тщательно перемешивает. После центрифугирования суспензии яйца окажутся на границе раздела фаз (мениске) и будут выглядеть мутными.

Перенесите каждую порцию яиц на отдельную не засеянную чашку с агаром NGM диаметром 10 сантиметров. Для смыва X на чашку можно использовать воду, но старайтесь свести количество переносимой жидкости к минимуму. Инкубируйте чашки в течение первой ночи при 20 degrees Celsius. Обеспечьте вентиляцию чашек, оставив крышки слегка приоткрытыми, но обязательно закройте их плотно на ночь.

После вылупления перенесите личинок стадии L1 в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, заполненную S basil. Осадите личинок L1 и ресуспендируйте их в минимальном объеме S basil. Затем разделите каждую группу L1 на две чашки с NGM-агаром диаметром 10 сантиметров, засеянные бактериями NA 22.

Контролируйте культуры один или два раза в день. Если возникнет риск голодания, перенесите их на свежие чашки с NA 22 до наступления этого состояния, так как в противном случае они образуют две собирательные линии типа N и начнут перемещаться вместе, подобно волне, прочь из зон с истощенными питательными веществами; на этих чашках питательная среда будет полностью израсходована в течение нескольких часов.

Когда черви достигают нужного возраста, они готовы к иммуноокрашиванию или прижизненной визуализации для последующего закрепления. Для конфокальной микроскопии используйте среду для закрепления Antifade, чтобы довести их плотность до нескольких сотен особей на µL.

С опытом эта плотность можно определять по мутности суспензии. В идеале черви должны располагаться на предметном стекле плотно, но без чрезмерного перекрытия друг друга. На стекле создайте каплю 2% арос в ESP basil, окружив ее тонким кольцом вазелина.

Чтобы предотвратить испарение во время визуализации, нанесите вазелин с помощью трехмиллилитрового шприца, оснащенного иглой 25 G с обрезанным кончиком. Теперь перенесите несколько микролитров суспензии червей на покровное стекло, используя наконечник пипетки с обрезанным концом, чтобы избежать механического повреждения червей, и опустите агарозную подушечку на покровное стекло, равномерно распределяя червей по подушечке под микроскопом. Интересующие синапсы должны быть ориентированы строго по направлению к объективу или в пределах 45 градусов от него.

Потратьте несколько секунд на этот этап, чтобы избежать фотообесцвечивания. Культура и условия должны обеспечить достаточное количество червей, соответствующих этому строгому критерию, представленному здесь в виде идеальной ориентации, когда вентральный нервный шнур направлен непосредственно к объективу микроскопа. Следующий экземпляр был бы отклонен, так как вентральный нервный шнур направлен в сторону от объектива.

Обратите внимание, что в данном образце спинной шнур ориентирован по направлению к объективу, что обеспечивает более четкое изображение. Вот еще один образец, который был бы отклонен, так как спинной и брюшной шнуры расположены у краев тела червя. В таком случае свет возбуждения и эмиссии должен пройти через больший объем тканей червя, что приведет к искажению изображения.

Основная задача заключается в минимизации вариабельности внутри групп лечения; синхронизация по возрасту и выбор червей, у которых интересующая структура ориентирована непосредственно в сторону объектива, могут существенно помочь. Использование крупных культур на начальном этапе расширяет выбор особей для обеспечения максимальной согласованности. Для получения наилучших результатов визуализации выбирайте относительно плоские образцы, которые можно охватить стеком из 14 или менее кадров.

Срезы толщиной 0,4 мкм. Для быстрого и точного сбора данных достаточно изображений с высокой скоростью съемки и низким разрешением. Избегайте насыщения детектора чрезмерно сильными сигналами, так как это приведет к занижению интенсивности сигналов флуоресценции.

В данной демонстрации используется коммерчески доступный программный пакет velocity версии не ниже 4.0. Многие альтернативные программы приводят к потере трехмерной информации. После открытия выходных файлов в формате multi tiff, полученных с конфокального микроскопа, выберите «image», затем «extended focus» и далее «freehand».

Теперь с помощью ROI (области интереса) обрежьте те части изображения, которые не содержат исследуемую структуру. С помощью активированного инструмента расширенного фокуса (extended focus) создается проекция по плоскости Z, что облегчает выбор ROI. Это не влияет на исходные данные.

Аналогично, регулировка яркости и контрастности не влияет на исходные данные. Завершите обрезку, выбрав в меню действий пункт «обрезать по выделенной области». Затем измерьте длину анализируемого участка.

С помощью инструмента «Линия» будет рассчитана длина линии, которая затем будет добавлена в таблицу данных. Теперь идентифицируйте объекты с помощью фильтра «Объекты по интенсивности» в режиме измерений. Использование независимого синаптического маркера, помеченного уникальным цветом, может помочь однозначно идентифицировать синапсы; установите порог таким образом, чтобы синаптические кластеры были выделены, а несинаптический фон — нет.

Выполните эту процедуру только один раз, используя контрольный образец, и применяйте полученный результат для всех последующих образцов; пороговая обработка каждого образца по отдельности недопустима, так как это создает риск возникновения систематической ошибки экспериментатора. Объекты выбираются и табулируются автоматически. Типичные синапсы имеют размер от нескольких до нескольких сотен вокселей; перед экспортом данных отсортируйте их по размеру объекта.

Это облегчает последующее удаление объектов размером в два вокселя или меньше, которые обычно представляют собой лишь фоновые помехи. Теперь экспортируйте данные в формате CSV, который открывается любой программой для работы с электронными таблицами. Каждое изображение создает один выходной файл для сортировки и экспорта микрофотографий вентрального нервного шнура CL gans; с помощью описанного протокола было получено 49 рецепторов GABA.

Все животные выглядели очень похожими по размеру и степени зрелости. Общие значения синаптической флуоресценции для пяти червей были нормализованы по длине анализируемого нервного ствола. Эти данные показали значения стандартной ошибки примерно 10% от среднего значения.

Изображение слева представляет собой необработанный снимок без применения порога отсечения и удаления фонового шума. Синапсы обрабатывали мускармалем, агонистом ГАМК-рецепторов, который вызывает снижение экспрессии рецепторов при длительном воздействии. Общая флуоресценция была количественно определена и нормализована по кумулятивной вероятности длины нервного ствола.

Были рассчитаны гистограммы содержания флуоресценции отдельных синапсов. Аналогичным образом был рассчитан объем синапсов. Эти измерения показывают, что воздействие агониста значительно снижает содержание и объем синапсов.

В целом, количественные результаты всегда должны соответствовать тому, что можно оценить визуально. Если это не так, изучение изображений и объектов, идентифицированных по скорости, должно помочь выявить причину ошибки и определить корректирующие действия, такие как корректировка порога или удаление артефактов при выполнении данной процедуры. Крайне важно выбирать червей для визуализации на основе их геометрической ориентации, а не субъективной оценки качества изображения; по возможности настоятельно рекомендуется проводить «слепой» подсчет.