NADH флуоресценции изолированных бивентрикулярной рабочей Кролик сердца

Общей целью этой процедуры является изучение обмена веществ. Использование визуализации NADH в препарате работающего сердца достигается путем первичной изоляции сердца кролика. Вторым этапом процедуры является успешная канюляция всех четырех камер сердца для достижения работающей модели сердца.

Последним этапом является настройка оборудования для визуализации и сбор данных NADH с разной скоростью. В конечном счете, результаты могут показать метаболические изменения в сердце с помощью визуализации флуоресцентной НАДН. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как ланор ретро изобилие, заключается в том, что сердце функционирует в своем физиологическом состоянии с потоком в нормальном направлении, а сердце обеспечивает собственное давление для коронарной перфузии.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы электрофизиологии и механизмов летальных аритмий. Это делается путем предоставления физиологической модели для изучения связи между метаболизмом коронарного кровотока и электрической активностью. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что этапы канюляции сосудов и камеры сердца трудно освоить.

Неправильная техника может повредить сердце и поставить под угрозу всю остальную часть эксперимента. Перед проведением эксперимента промойте все трубки в камерах работающей сердечной системы очищенной водой, а затем очистите систему от воды, запустив насосы. Добавьте фильтры из целлюлозной мембраны в соответствии с перфузионным насосом LOR, перфузионным насосом для левого сердца и перфузионным насосом для правых отделов сердца.

После добавления в систему перфузии восемь выполните двухточечную калибровку для каждого датчика давления. Включите нагретую циркуляционную водяную баню, которая прогревает трубки с водяной рубашкой и теплообменники Включите водяную баню. Используется для нагрева PERFUSE восьмерка.

Включите насосы, которые обеспечивают циркуляцию перфузионной восьмерки в замкнутом контуре, включите циркуляционный бак для насыщения перфузии кислородом. В-восьмых, убедитесь, что оксигенатор из микрофибры или гемофильтры подают 95% кислорода в перфуз при 80 килпаскалях. Наконец, убедитесь, что теплообменники поддерживают температуру циркуляционного перфузиона.

Восемь при 37 градусах Цельсия начинают иссечение сердца, сначала настроив работающую сердечную систему на работу под постоянным давлением. Режим LRF. Установите давление аортальной блокады в диапазоне от 50 до 60 после успокоительного кролика.

Введите пентобарбитал и гепарин либо в краевую вену уха, либо в боковую подкожную вену на внутренней стороне задней конечности. Как только у кролика отсутствует болевой рефлекс, быстро откройте грудную полость. Разрежьте перикард, зажмите аорту и иссеките сердце и легкие.

Легкие остаются прикрепленными, чтобы облегчить изоляцию легочных вен. Далее наполните шприц 60 миллилитров на F восемь и 200 единиц гепарина. Прикрепите пятимиллиметровую канюлю и канюлируйте аорту.

Закрепите аорту на канюле шелковыми швами нулевого размера. Затем медленно нажмите на шприц, чтобы вымыть кровь через сердце. Настройте работающую сердечную систему, сначала подключив сердце к аортальной блокаде.

Подойдите к разъему под косым углом и позвольте Perfuse eight аккуратно капнуть из разъема в канюлю, пока он прикреплен. Это предотвращает попадание воздуха в аорту, тем самым предотвращая коронарную эмболию в то время, когда сердце перфузируется под постоянным давлением. L эндорфный режим.

Удалите жир и соединительную ткань и найдите следующие сосуды. Нижняя и верхняя полая вена, вена, легочная артерия и легочные вены. Далее перевязывают верхнюю полую вену.

Разрежьте легочную артерию чуть ниже того места, где она разветвляется на правую и левую легочные артерии. Остальные сосуды – это легочные вены. Сгруппируйте их между сердцем и легкими и перевязайте их все с помощью одного шва.

Это имеет решающее значение по двум причинам. Во-первых, перевязывание сосудов, соединенных с легкими, обеспечит отсутствие утечки после завершения канюляции. Во-вторых, важно изолировать обе кавы ВНА для последующей канюляции.

Теперь удалите легкие. Вырежьте отверстие подходящего размера в углу ушка левого предсердия и убедитесь, что оно заполнено обильной восьмеркой. Далее канюляционируйте придаток, пока канюля полностью заполнена перфузой восемь.

Затем, удерживая ткань, пришить канюлю к придатку. Ткань ушка левого предсердия чрезвычайно нежная и может легко порваться. Поэтому важно канюлировать левое предсердие с первой попытки, иначе это может оказаться невозможным.

Включите насос номер два, чтобы обеспечить приток к левому предсердию. Установите преднатяг в диапазоне от двух до шести тор на протяжении всего эксперимента. Возможно, потребуется отрегулировать давление.

Держите его в пределах двух миллиметров от целевого давления. Теперь переключите сердце в режим работы сердца, выключив насос номер один, насос Лангора на мгновение. Уменьшите давление в аорте, чтобы выровнять тор, а затем медленно увеличивайте его в диапазоне от 80 до 100 тор

Это позволяет аортальному клапану открыться и функционировать так, как это было бы при нормальных физиологических условиях. Установите конечное давление после нагрузки на значение, которое составляет примерно 20. Разрыв давления ниже пикового ЛЖ с помощью канюли, непосредственно прикрепленной к системе.

Канюляют правое предсердие через нижнюю полую вену CVA и пришивают канюлю к вене. Избегайте попадания пузырьков воздуха. Включаем насос номер три, правый боковой насос для обеспечения потока в правый предсердий.

Установите давление примерно на три тора. Наконец, канюляция правого желудочка, не допуская проникновения воздуха, и пришить канюлю к легочной артерии. На этом бивентрикулярная канюляция завершается.

Теперь перейдем к захвату сигнала. Осторожно введите катетер датчика давления в аорту через канюлю аорты. Аккуратно проведите его мимо аортального клапана в lv.

Сигнал давления ЛЖ будет отображаться как и ожидалось, когда наконечник катетера расположен правильно. Далее аккуратно прижмите электрод потенциала монофазного действия к эпикарду желудочка. Незначительный артефакт движения в сигнале электрода является нормальным явлением.

Затем поместите электрод биполярного стимула в правое предсердие, чтобы кардиостимуляция сердца в соответствии с положением экспериментального дизайна. И сфокусируйте ПЗС-камеру на интересующей области сердца. К камере должен быть прикреплен фильтр излучения.

Для прохождения флуоресценции NADH выключите окружающее освещение, чтобы равномерно освещать эпикард источником ультрафиолетового света на рабочем месте, к которому прикреплена камера. Настройка программного обеспечения на получение изображений с частотой два кадра в секунду. Затем выберите режим обновления в реальном времени, чтобы отслеживать среднюю интенсивность пикселей в пределах интересующей области.

Если обильность была адекватной, уровни НАДН, представленные флуоресценцией, должны быть низкими и стабильными на поверхности эпикарда. Теперь запустите эксперимент, когда он будет завершен. Удалите сердце.

Слейте воду из восьмерки PERFUSE и системы трубок и камер с очищенной водой. Периодически промывайте систему раствором слизистой ТМ или разведенным раствором перекиси водорода по намеченному протоколу. Сердца вставлялись с длиной цикла от 200 до 400 ударов в минуту.

Диастолическое давление обычно составляет от нуля до 10 тор, минимальное диастолическое давление в аорте составляет примерно 60 тор, пиковое систолическое давление в зависимости от давления наполнения и сократительной способности и оптимально должно составлять от 60 до 80. Максимальное давление в аорте и максимальное ЛЖП должны близко соответствовать монофазному действию Потенциалы, типичные для сердца кролика, имеют быструю фазу деполяризации и характерную фазу реполяризации. Потенциалы действия легко регистрировались из препаратов, но обычно имели небольшой артефакт движения во время диастолы.

Средние флуоресцентные значения НАДН из интересующей области в красном ящике были измерены для мониторинга изменений окислительно-восстановительного состояния митохондрий в течение трех циклов стимуляции с длительностью 300, 200 и 150 миллисекунд, когда скорость стимуляции была близка к синусовому ритму. Исходный уровень НАДН был относительно постоянным по мере сокращения продолжительности цикла. Ниже 300 миллисекунд исходный уровень НАДН увеличивается, причем наибольший рост происходит через 150 миллисекунд, сигнал колеблется с сокращением, а частота колебаний соответствует частоте сердечных сокращений.

Амплитуда этих колебаний всегда была меньше, чем любые более длительные временные тренды, вызванные ишемией или гипоксией. Флуоресцентная NADH визуализация всей передней поверхности с высоким разрешением при 200 ударах в минуту была постоянной и пространственно однородной при 400 ударах в минуту. Уровень НАДН значительно увеличивался по всему эпикарду.

Наблюдалась значительная пространственная неоднородность, причем наибольшее увеличение происходило в пределах септальных областей ПЖ и ЛЖ после освоения. Эта техника может быть выполнена менее чем за 45 минут, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что пузырьки воздуха не должны попадать в аорту или левое предсердие после этой процедуры.

Дополнительные методы, такие как нагрузка на сердце чувствительным к напряжению красителем, могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы, такие как связь электрической и метаболической активности на поверхности сердца во время патологических сценариев, таких как локальная ишемия после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области физиологии сердца к изучению сердечного метаболизма и нарушений проводимости во время патологических состояний с использованием более физиологически релевантной модели.