Количественное измерение Invadopodia-опосредованного протеолиза внеклеточной матрицы в одно-и многоклеточных контексты

Данный стандартный метод позволяет получить предметные стекла, покрытые флуоресцентно-меченым желатином, которые подходят для количественного анализа деградации матрикса инвазивными подосомами. После нанесения на предметные стекла флуоресцентно-меченого желатина высейте клетки и культивируйте их для проведения деградации матрикса. Затем зафиксируйте клетки и окрасьте их флуоресцентными метками на белки-маркеры инвазивных подосом, получите изображения и количественно оцените деградацию матрикса.

Типичные результаты позволяют количественно оценить различия в опосредованной подучками (podia) деградации матрикса между клетками с различной манипуляцией выбранными генами или при воздействии фармакологических агентов. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как подготовка покрывных стекол с желатиновым покрытием и однородной флуоресценцией труднодостижима из-за неравномерного нанесения флуоресцентного желатина или неправильного обращения с покрытиями. Процедуру продемонстрируют старший научный сотрудник Карен Мартин, постдок Мэнди Аммер и аспиранты Элис Уолк, Карен Хейз и Стив Маркуэлл.

Для приготовления немаркированного стокового раствора 5% желатина и сахарозы смешайте желатин и сахарозу в PBS и полностью растворите при 37 °C. Затем храните при температуре 4 °C. Перейдите к очистке стеклянных покровных стекол.

Поместите по одному покровному стеклышку в каждую лунку 24-луночного пластикового планшета для культивирования тканей, добавьте в каждую лунку 500 microliters 20% азотной кислоты и инкубируйте в течение 30 минут. После удаления раствора азотной кислоты трижды промойте покровные стеклышки деионизированной водой. Затем приступайте к нанесению покрытия.

На каждое покровное стекло нанесите 500 µL полилизина в концентрации 50 µg/mL и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Удалите раствор полилизина и трижды промойте PBS. Покрытие поли-L-лизином способствует равномерному нанесению и связыванию последующего слоя меченого желатина. Поместите 24-луночные планшеты на лед и добавьте в каждую лунку 500 µL свежеприготовленного 0,5% глутаральдегида.

Инкубируйте планшеты на льду в течение 15 минут. Выполните три промывки холодным PBS, затем полностью удалите остатки PBS перед нанесением желатинового покрытия. Тем временем, во время инкубации с глутаральдегидом, восстановите желатин, конъюгированный с Oregon Green 488.

Согласно протоколу производителя, подогрейте этот раствор и немаркированный 5% стоковый раствор желатина с сахарозой до 37 °C. Затем разведите 500 µL маркированного желатина в четырех миллилитрах немаркированного желатина с сахарозой. Пипетируйте 100 µL разведенной смеси желатина 4 88 на каждое покровное стекло.

Используйте достаточное количество желатина, чтобы покрыть покровное стекло без необходимости ручного распределения. Важно поддерживать температуру разведенной смеси желатина 4 88 на уровне 37 °C во время процедуры нанесения покрытия, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание. Кроме того, начиная с этого этапа, держите покровные стекла в темноте по мере возможности, чтобы избежать потенциального фотовыгорания.

После того как все покровные стекла на одной планшете будут покрыты, наклоните планшет и удалите излишки желатина из каждой лунки с помощью вакуумной аспирации. Затем инкубируйте покрытые покровные стекла в темноте в течение 10 минут при комнатной температуре. После трехкратного промывания покровных стекол раствором PBS добавьте 500 µL боргидрида натрия.

Борогидрид вызывает эффересценцию, и на покровных стеклах и вокруг них будут видны мелкие пузырьки; инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы восстановить и инактивировать остаточный глутаральдегид. Удалите раствор борогидрида натрия с помощью вакуумного аспиратора быстрым sweeping-движением по периферии каждой лунки; будьте осторожны, чтобы не захватить плавающие покровные стекла, которые могли отсоединиться от дна планшета для культивирования тканей во время обработки борогидридом натрия. После трех промывок PBS инкубируйте покровные стекла в 70% ethanol в течение 30 минут при комнатной температуре.

Соблюдая правила асептики, перенесите покровные стекла с планшетами в ламинарный шкаф для культивирования B-клеток второго типа и трижды промойте стекла стерильным PBS, используя стерильную иглу и пинцет. Осторожно перенесите покровные стекла в пустую лунку нового 24-луночного планшета и уравновесьте их в культуральной среде, соответствующей конкретному типу используемых клеток.

Теперь, по истечении соответствующего времени инкубации, высейте клетки непосредственно на покровные стекла. Подготовьте образцы для иммунофлуоресцентной визуализации, чтобы закрепить их. Поместите каплю Prolong Gold Antifade или аналогичного реагента на предметное стекло микроскопа, осторожно установите на нее перевернутое покровное стекло и получите изображения для анализа.

Этот анализ позволяет определить нормализованную площадь деградации матрикса относительно площади клеток или количества клеток. Он полезен для анализа всего микроскопического поля зрения, в котором присутствует несколько клеток, подвергшихся совместному воздействию факторов роста irna или терапевтических агентов. Для данного анализа используются изображения, полученные при меньшем увеличении, достаточном для эффективного сбора информации о популяциях клеток.

Откройте изображение в программе ImageJ. Проверьте информацию о масштабе и выберите параметры измерений. Выберите опции «Area» (площадь) и «Limit to threshold» (ограничить пороговым значением). Рассчитайте площадь деградации по флуоресцентному изображению желатина, скорректировав неоднородность освещения по всему желатину путем вычитания фонового порога; установите верхние и нижние значения интенсивности пикселей для изображения.

На последующих изображениях используйте кнопку «set» в окне порога (threshold), чтобы установить одинаковый порог для всех изображений в качестве объективного способа выделения области деградации. Используйте функцию «analyze particles» для измерения порога в областях деградации матрикса.

Выберите размер частиц больше нуля, чтобы удалить шум из области выделения. Включите отображение контуров для идентификации интересующих областей. Затем отметьте пункты «display results» (отобразить результаты) и «summarize» (сводка), чтобы показать измерения, если на рисунке были точно обведены все области деградации.

Скопируйте значение общей площади в электронную таблицу; если были выбраны другие объекты, такие как мусор, фиксируйте только площади соответствующих интересующих областей. Затем, для расчета площади клеток, откройте foid и установите порог яркости изображения, задав верхние и нижние значения интенсивности пикселей таким образом, чтобы на последующих изображениях были выделены границы клеток. Используйте кнопку «set» в окне порога, чтобы установить одинаковый порог для всех изображений.

Для объективного выбора области клеток используйте функцию анализа частиц (analyze particles) для измерения порогового значения площади клеток. Выберите размер частиц больше нуля, чтобы исключить шум из выделения.

Отобразите контуры для определения областей анализа, проверьте результаты отображения и сформируйте сводку для вывода значений площади. Не ставьте галочку. Включите отверстия, если между клетками и кластером имеются промежутки.

Теперь выберите следующее. Скопируйте результаты измерения площади соответствующих интересующих областей в электронную таблицу и рассчитайте площадь деградации желатина на общую площадь клеток. Альтернативный подход заключается в нормировании площади деградации по количеству клеток, определенному путем подсчета ядер, окрашенных DAPI.

Это важно, если в результате манипуляций изменяется средняя площадь клеток. Для реализации данного подхода используйте плагин nucleus counter для автоматического подсчета ядер. Настройте параметры для оптимизации работы с вашими изображениями. Если ядра сильно перекрывают друг друга, автоматический подсчет в данном случае может не обеспечить точного количественного определения.

При правильном выполнении ручной подсчет может быть облегчен с помощью плагина для подсчета клеток. Предметные стекла равномерно покрывают желатином, конъюгированным с Oregon Green 488. В процессе покрытия и обработки предметных стекол, покрытых желатином, могут возникать различные артефакты.

Например, неравномерное покрытие возникает из-за неправильного заполнения покровного стекла в процессе нанесения слоя вследствие плохого перемешивания, ручного распределения или частичного затвердевания желатиновой смеси. Царапины указывают на удаление нанесенного матрикса в результате повреждения иглами или пинцетом во время манипуляций. Высыхание поверхности покровного стекла при длительном хранении может привести к появлению структуры, напоминающей «булыжную мостовую». Данная область отражает фотообесцвечивание флуоресцентной поверхности желатина во время визуализации из-за длительного или высокоинтенсивного воздействия света.

Обратите внимание, что правильно подготовленное покровное стекло демонстрирует гомогенную флуоресценцию при микроскопическом исследовании. Тонкие матрицы, полученные в результате данной процедуры, представляют собой чувствительный метод оценки способности клеток деградировать ECM. Например.

На этих изображениях запечатлена активность деградации матрикса подиума при инвазии клетки рака головы и шеи линии OSC 19. Клетки высевали на покровное стекло с желатином, конъюгированным с Oregon Green 488, и визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии, что представлено как в 2D, так и в 3D изображениях. Клетки OSC 19, высеянные на покровные стекла с желатином, конъюгированным с Oregon Green 488, были помечены конъюгированным с родамином фибронектином и антителами к кортиксактину, визуализированными с помощью вторичных антител ANOR 647; инвазия представлена в псевдоцветах зеленого цвета.

На совмещенном изображении видны подии, представляющие собой фокальные цитоплазматические скопления F-актина и кортанина, которые перекрываются с областями просветления желатина (объемы заполнения). Визуализация демонстрирует, как инвазивные подии проникают в суб-объем ECMA; данный ракурс был создан, чтобы показать внутренний край клетки, где присутствуют инвазивные подии. Вид дорсального края демонстрирует инвазивные подии, внедренные в нижележащий желатин.

Вид вентрального края демонстрирует протрузию в подали Veda и области деградации желатина под покровным стеклом, где красные зоны перекрывают зеленую матрицу. На этих изображениях показаны некоторые из важных этапов количественного определения нормализованной деградации желатиновой матрицы клетками в пределах всего микроскопического изображения. Все флуоресцентные изображения были преобразованы в градации серого для более наглядного отображения красного порога и отметок областей интереса.

На этом изображении желатина, конъюгированного с Oregon Green 488, темными областями отмечены участки деградации. После применения пороговой обработки на изображении желатина выделяются зоны деградации, в которых измеряется площадь выбранных областей интереса. На данном изображении, как и ожидалось, видны румины, фоиды и окрашивание f-актина.

Порог на изображении актина выделяет общую площадь клетки, из которой выбираются области клетки для последующих измерений. Аналогичным образом данный метод может быть применен для анализа изображений ядер клеток, окрашенных DAPI. На этой панели продемонстрированы отдельные этапы количественного определения деградации флуоресцентного желатина отдельными клетками в смешанной клеточной популяции.

Данный простой количественный анализ проведен для одной трансфицированной клетки OSC 19, экспрессирующей рекомбинантный корти-актин, слитый с флаг-эпитопным тегом. Обратите внимание, что деградация матрикса трансфицированными клетками может быть проанализирована и в смешанной популяции трансфицированных и нетрансфицированных клеток. При выполнении этой процедуры важно помнить о нескольких вещах.

Сначала убедитесь, что ваши флуоресцентные маркеры клеток не перекрываются по цвету с флуоресцентным желатином. При сборе изображений важно выбирать поля зрения исходя из наличия клеток. Не ищите намеренно области деградации, так как это может привести к систематической ошибке в данных из-за вариабельности клеточных линий и их реакций на различные терапевтические агенты.

Такие факторы, как время деградации в зависимости от номера лунки и выбор белка для иммунофлуоресцентного мечения, должны быть оптимизированы для вашего конкретного эксперимента. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать покровные стекла с равномерным покрытием флуоресцентным желатином для анализов деградации, опосредованной beta-подиумами, а также об методах количественной оценки деградации матрикса.