Nanotopology клеточной адгезии по переменным углом полного внутреннего отражения микроскопия флуоресцентная (VA-TIRFM)

Общая цель данной процедуры заключается в измерении топологии клеточной адгезии на подложке с нанометрической точностью. Для этого сначала клетки культивируют на прозрачных стеклянных предметных стеклах и инкубируют с флуоресцентным маркером. Затем калибруется угловое положение регулируемого зеркала микроскопа, и это положение сохраняется в программе позиционирования зеркала.

Следующим шагом является регистрация флуоресцентных изображений при облучении примерно под 10 различными углами. Заключительный этап заключается в расчете расстояний между клетками и субстратом с точностью до нескольких нанометров. В конечном итоге результаты анализа топологии адгезии клеток к субстрату используются для демонстрации различий в адгезии между различными клеточными линиями, например, между раковыми и менее злокачественными клетками.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как конфокальная микроскопия, является то, что фактическое разрешение составляет всего несколько нанометров. Хотя этот метод позволяет получить представление о клеточных мембранах, его также можно применять к другим системам, таким как малые везикулы или наноматериалы.

Эксперимент продемонстрирует наш постдок Петра, которая подготовит клеточные образцы, и наш инженер Майкл Вагнер, который проведет исследование. Чтобы подготовить клетки для флуоресцентной микроскопии с общим внутренним отражением под переменным углом, высейте отдельные клетки с плотностью 100 cells/mm² на предметное стекло с культуральной средой, дополненной 10% fetal calf serum и антибиотиками. Культивируйте клетки в течение 72 hours в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.

Затем добавьте к клеткам флуоресцентный мембранный маркер 6-DDEC (N,N-диметил-2-(4-(диэтиламино)фенил)этан-1,2-дикарбоксамид) или Лоран в концентрации 8 µM в культуральной среде и инкубируйте в течение 60 минут перед флуоресцентной микроскопией. Промойте клетки раствором PBS, аккуратно pipet-ируя буферный раствор по предметному стеклу для удаления среды, после чего удалите остатки буферного раствора с обратной стороны предметного стекла. Для съемки под разными углами используется вертикальный микроскоп, такой как Zeiss Axio plan, оснащенный системой обратного освещения и/или камерой exon EMCCD.

В TIRFM конденсатор заменен специально изготовленным устройством освещения с полуцилиндрической стеклянной призмой, оптически сопряженной с предметным стеклом. Лазерный луч поступает из коллимированного одномодового волокна, которое после формирования изображения стеклянной призмой и другими оптическими компонентами снова создает параллельный пучок на поверхности образца. Убедитесь, что вектор электрического поля поляризован перпендикулярно плоскости падения.

Эта позиция отмечена на выходном ответвителе волокна. Используйте регулируемое зеркало, расположенное внутри конденсатора, которое проецируется в плоскости образца и освещает образец под переменным углом падения или объектного луча. Регулируемое зеркало может приводиться в движение шаговым двигателем, управляемым с помощью программного обеспечения.

Каждое положение соответствует определенному углу падения, установленному на основе гонометрических измерений. Для калибровки углового положения регулируемого зеркала используйте флуоресцентный краситель, например, 1 mM флавиннуклеотид, растворенный в воде. Для визуализации критического угла при изменении угла падения в качестве фиксированного значения используйте критический угол 61,3 градусов для границы раздела стекло-вода; угловое положение зеркала, при котором угол падения равен критическому углу, сохраняется в программе позиционирования зеркала.

С помощью программного обеспечения камеры установите параметры EMCCD-камеры, включая температурный коэффициент усиления, время записи и скорость сдвига. Для обеспечения оптического контакта с образцом используйте иммерсионное масло. С помощью стеклянной призмы выберите объектив с подходящим для данных клеток увеличением и умеренной числовой апертурой.

Для визуализации объекта под микроскопом используйте подходящий длинноволновой или полосовой фильтр для детектирования флуоресценции. Зарегистрируйте флуоресцентные изображения идентичных образцов при изменении угла освещения. Углы падения должны быть равны критическому углу или превышать его.

При критическом угле, соответствующем 64,5 градуса для границы раздела «кювета — стекло», рекомендуется использовать угловой диапазон от 66 до 74 градусов с шагом 0,5 или 1 градус. Для начала анализа данных используйте программу LabVIEW для считывания изображений, записанных при различных углах, а также настроек камеры, длины волны возбуждения и показателей преломления. Для обеспечения правильной оценки данных импортируются значения показателей преломления для стекла (1,52) и клеток (1,37).

Для каждого набора параметров глубина проникновения и коэффициент пропускания рассчитываются автоматически. Для успешного проведения процедуры важно тщательно регистрировать и отбирать изображения для анализа. Выберите изображения, используемые для оценки расстояния между клетками и субстратом, в соответствии с уравнением.

Для маркера мембраны можно исключить отдельные изображения с однородным освещением, как показано в данном примере. Рассчитайте изображения топологии субстрата клеток и выберите подходящий цветовой код для отображения во время оценки. Профили отдельных пикселей могут быть отображены так, как показано на этом рисунке.

Эти профили могут быть использованы в качестве индикатора качества аппроксимации. Наконец, сохраните протокол оценки. На данном рисунке представлены изображения клеток глиобластомы U2 51, полученные методом полного внутреннего отражения, с активированным геном-супрессором опухоли TP 53.

При инкубации с luan при различных углах падения — 66°, что соответствует глубине проникновения затухающего электромагнитного поля около 140 nanometers, 69°, что соответствует глубине проникновения 75 nanometers, и 73°, что соответствует глубине проникновения 60 nanometers, — с уменьшением глубины проникновения интенсивность флуоресценции снижается, и она исходит из более поверхностных участков клеток, таких как фокальные контакты на их краях. Расстояния между клетками и субстратом показаны на панели D цветовым кодом в диапазоне от 0 до 600 nanometers, как видно здесь.

Расстояния между клетками и субстратом значительно варьируются: от нескольких нанометров (обозначены белым и желтым цветом) до 250–300 нанометров (обозначены темно-красным цветом). Это указывает на то, что фокальные контакты и области с большим расстоянием между клеткой и субстратом находятся в непосредственной близости. Аналогичная вариация расстояний между клетками и субстратом рассчитана для клеток глиобластомы U2 51 mg с активированным геном супрессора опухоли P 10.

Напротив, расстояние между клеткой и субстратом остается практически неизменным для контрольных клеток U2 51 mg, обозначенных желтым цветом, и клеток дикого типа, обозначенных цветом от оранжевого до красного, после ее разработки. Данный метод открыл исследователям в области топологии клеточного субстрата путь к изучению опухолевых клеток и морфологических изменений при лазерной терапии. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как визуализировать поверхности с фактическим разрешением в нанометровом диапазоне при низкой экспозиции света, которая хорошо переносится живыми организмами.