Nanotopology клеточной адгезии по переменным углом полного внутреннего отражения микроскопия флуоресцентная (VA-TIRFM)

Общая цель этой процедуры заключается в измерении топологии клеточной адгезии на подложке с нанометровой точностью. Для этого сначала культивируют клетки на прозрачных стеклянных предметных стеклах и инкубируют их с помощью флуоресцентного маркера. Затем угловое положение регулируемого зеркала микроскопа калибруется, и это положение сохраняется в программе позиционирования зеркала.

Следующим шагом является запись флуоресцентных изображений при облучении примерно под 10 различными углами. Заключительным этапом является расчет расстояний между клеточной подложкой с точностью до нескольких нанометров. В конечном счете, результаты топологии клеточной адгезии на субстрате используются для того, чтобы показать различия адгезии между различными клеточными линиями, например, раковыми клетками и менее злокачественными клетками.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как конфокальная микроскопия, заключается в том, что фактическое разрешение находится в диапазоне всего нескольких нанометров. Хотя этот метод может дать представление о клеточных мембранах. Его также можно применять к другим системам, таким как небольшие везикулы или наноматериалы.

Демонстрировать эксперимент будут наш постдок Петра, который подготовит образцы клеток, и наш инженер Михаэль Вагнер, который проведет эксперимент по подготовке клеток к переменному углу и полному внутреннему отражению. Флуоресцентная микроскопия семян отдельных клеток с плотностью 100 клеток на квадратный миллиметр на предметном стекле в культуральной среде с добавлением 10% плода теленка, сыворотки и антибиотиков. Выращивайте клетки в течение 72 часов в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Далее наносят на клетки флуоресцентную мембрану, маркер 6 D, декано два, диметиламинонафталин или лоран в концентрации восемь микромоляров в культуре, среду инкубируют в течение 60 минут перед флуоресцентной микроскопией. Промойте ячейки пипеткой PBS, нанесите буферный раствор на предметное стекло, чтобы удалить среду, затем сотрите буферный раствор с обратной стороны предметного стекла. Вертикальный микроскоп, такой как Zeiss Axio plan, оснащенный камерой с задней подсветкой и/или экзонной камерой E-M-C-C-D, используется для переменного угла наклона.

T-I-R-F-M заменяет свой конденсатор на специально изготовленное осветительное устройство с полуцилиндрической стеклянной призмой, оптически соединенной со предметным предметом. Лазерный луч падает из коллированного мономодового волокна, которое после получения изображения стеклянной призмой и другими оптическими компонентами снова приводит к параллельному лучу на поверхности образца. Следите за тем, чтобы вектор электрического поля был поляризован, перпендикулярен плоскости происшествий.

Это положение отмечено на выходном соединителе волокна. Используйте регулируемое зеркало, расположенное внутри конденсора, которое отображается в плоскости образца и освещает образец под переменным углом падения или луча объекта. Регулируемое зеркало может приводиться в движение шаговым двигателем, который управляется программным обеспечением.

Каждое положение соответствует четко определенному углу падения, определенному с помощью измерений в метрической метрике. Для калибровки углового положения регулируемого зеркала используйте флуоресцентный краситель, такой как один миллимолярный флавин нуклеотид, растворенный в воде. Чтобы визуализировать критический угол при изменении угла падения, используйте критический угол 61,3 градуса для перехода стекла в воду в качестве фиксированной величины, угловое положение зеркала, при котором угол падения равен критическому углу, сохраняется в программе позиционирования зеркала.

С помощью программного обеспечения камеры задайте параметры камеры E-M-C-C-D, включая повышение температуры, время записи и скорость переключения передач. Используйте иммерсионное масло для обеспечения оптического контакта образца. С помощью стеклянной призмы подбираем объектив с подходящим увеличением для ячеек и умеренной числовой диафрагмой.

Чтобы визуализировать объект в микроскопе, используйте подходящий фильтр длинных или полосовых пропусканий для обнаружения флуоресценции. Запись флуоресцентных изображений идентичных образцов при изменении угла освещения. Углы происшествий должны быть такими же или больше критического угла.

При критическом угле, соответствующем 64,5 градусам для границы раздела стеклопакета ячеек, рекомендуется угловой диапазон от 66 градусов до 74 градусов с шагом 0,5 градуса или одного градуса. Чтобы начать анализ данных, используйте программу лабораторного просмотра для считывания изображений, записанных под разными углами, а также настроек камеры, длины волны возбуждения и показателей преломления. Для стекла, которое равно 1,52, и ячеек, которое равно 1,37, настройки импортируются для правильной оценки данных.

Для каждого набора параметров глубина проникновения и коэффициент пропускания рассчитываются автоматически для успешности процедуры. Важно, чтобы изображения были тщательно записаны и отобраны для анализа. Выберите изображения, используемые для оценки расстояний между клеточным субстратом в соответствии с уравнением.

Для мембранного маркера отдельные изображения при однородном освещении, как показано в этом примере, могут быть исключены. Рассчитайте изображения топологии клеточного субстрата и выберите подходящий цветовой код для отображения во время оценки. Профили отдельных пикселей могут быть отображены так, как показано на этом рисунке.

Эти профили можно использовать в качестве индикатора качества посадки. Наконец, сохраните протокол оценки. На этом рисунке изображены изображения полного внутреннего отражения клеток глиобластомы U2 51 мг с активированным геном-супрессором опухолей TP 53.

При инкубации с луаном регистрируют при различных углах инциденты, 66 градусов соответствуют глубине проникновения затухающего электромагнитного поля около 140 нанометров, 69 градусов соответствуют глубине проникновения 75 нанометров и 73 градуса соответствуют глубине проникновения 60 нанометров с уменьшающейся проникающей способностью. Глубинная флуоресценция уменьшается по интенсивности и возникает из более поверхностных участков клеток, таких как фокальные контакты на их краях. Расстояния до подложек клеток изображены на панели D цветовым кодом в диапазоне от нуля до 600 нанометров, как показано здесь.

Расстояния между клеточной подложкой сильно варьируются от нескольких нанометров, обозначенных белым или желтым, и от 250 до 300 нанометров, обозначенных темно-красным. Это указывает на то, что фокальные контакты и большие расстояния между клеточным субстратом находятся в непосредственной близости. Аналогичная вариация расстояний между клеточным субстратом рассчитана для клеток глиобластомы U2 51 мг с активированным геном-супрессором опухолей P 10.

Напротив, расстояния между клеточным субстратом довольно постоянны для контрольных клеток U2 51 мг, представленных желтыми и дикими клетками, представленными оранжевым или красным после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области топологии клеточного субстрата к изучению опухолевых клеток и морфологических изменений при лазерной терапии. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как визуализировать поверхности с фактическим разрешением в нанометровом диапазоне при низкой освещенности, что хорошо переносится живыми организмами.