Малая ядерная Экстракты для функционального анализов экспрессии генов Machineries

Общая цель данного эксперимента заключается в анализе экспрессии генов с помощью функциональных ядерных аппаратов, извлеченных из клеток. Это достигается путем предварительного забора в набухающие клетки хелы. Затем клетки связывают пухом, а затем центрифугируют для гранулирования ядер на третьем этапе.

Ядра экстрагируются солью, концентрируются и диализуются с целью получения растворимых и функциональных механизмов экспрессии генов. В конечном счете, функциональность ядерных экстрактов может быть оценена на основе их транскрипционной и сплайсинговой активности, оцененной с помощью связанной РНК-полимеразы с транскрипцией и системой сплайсинга. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как получение объемного экстракта ядер, заключается в том, что с помощью этого метода для приготовления экстракта ядер можно использовать небольшое количество клеток.

Начните с нанесения клеток hela на три 150-миллиметровые пластины с помощью среды DMEM, дополненной FBS и антибиотиками, выращивайте культуры в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% CO2 до тех пор, пока клетки не достигнут 90% CO на этом этапе, аспирируйте среду из клеточных культур HELOC и промойте их один раз 13 миллилитрами комнатной температуры. PBS на тарелку затем аспирировать. PBS ставит каждую пластину на бок на несколько секунд и аспирирует остальную часть PBS.

Затем с помощью клеточного подъемника соскребите клетки до нижнего края каждой пластины, а затем вытяните клетки в 1,5-миллилитровую эйноровую трубку. Наконец, гранулируйте клетки в микрофуге в течение пяти минут при ста температурах G и четырех градусах Цельсия. Теперь отберите PBS из клеточной гранулы и оцените объем упакованной клетки или PCV, глядя на градацию на трубке.

Затем добавьте в клеточную гранулу в два раза больше гипотонического буфера, чем PCV. Осторожно встряхните трубку, чтобы она снова закрепилась. Клетки осторожно пипетируют клеточную суспензию вверх и вниз с помощью пипетки объемом 1000 микролитров, чтобы при необходимости вытеснить клеточные кластеры.

Затем гранулируйте ячейки в тех же условиях центрифуги, что и раньше. После центрифугирования тщательно аспирируйте гипотонический буферный слой. Клетки начнут разбухать, и объем клеток увеличится примерно до 750-1000 микролитров.

Добавьте новый гипотонический буфер до конечного объема 1,5 миллилитра и ресуспендируйте клетки в буфере. Снова. Наконец, инкубируйте ресуспендированные опухшие клетки на льду в течение 10 минут, пока клетки охлаждаются. Промойте пуховый гомогенизатор гипотоническим буфером, а затем положите его на лед вместе с клетками.

Затем с помощью деликатного салфетки, такого как салфетка Кима, высушите пестик. Используйте удлиненный наконечник для микропипетки объемом 1000 микролитров, чтобы удалить буфер из пуха. Теперь с помощью пипетки перенесите охлажденные набухшие клетки в пух

Это самая сложная часть этой процедуры для успешного входа Проверка на лизис. После каждого опускания под микроскоп медленно двигайте тугим пестиком пухов вверх и вниз пять раз, чтобы вскрыть клетки, стараясь не допустить образования пузырьков. Затем переложите пять микролитров Eloqua суспензии клеток lys в пробирку эйнора и добавьте 10 микролитров трианового синего и 15 микролитров одного XPBS.

Добавьте клеточный раствор на предметное стекло и рассмотрите клетки под световым микроскопом на предмет лизиса, ядра клеток лиз будут казаться голубыми уже через три унции. Лизиса недостаточно, так как видны многочисленные живые клетки. После пяти унций достаточно лизиса.

Наконец, перенесите клетки lys в предварительно охлажденную пробирку эйнора и вращайте клеточную суспензию в течение пяти минут в микрофуге при температуре 1500 G и четырех градусах Цельсия. Затем аккуратно переложите супер натин в новую трубку, не нарушая гранулу. Теперь оцените объем ядра пластыря или ПНВ, посмотрев на градацию на трубке.

Заполните наконечник микропипетки буфером с низким содержанием соли на половине ПНВ. Затем вставьте наконечник микропипетки в ядра в нижней части пробирки эйнора. Медленно впрыскивая буфер в ядра, аккуратно перемешивая.

Осторожно переверните трубку, чтобы убедиться, что гранула полностью ресуспендирована. Затем добавьте буфер с высоким содержанием соли на одну половину PNV и быстро перемешайте один раз, перевернув трубку. Вращайте трубку в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

Наконец, вращайте ядра в микрофуге в течение 15 минут при температуре 18 000 G и четырех градусах Цельсия. Начните с пересадки 500 микролитров надосадочной жидкости в охлажденные микроконы. После центрифугирования уменьшите ядерный экстракт с высоким содержанием соли в течение 15 минут при температуре 14 000 G и четырех градусах Цельсия, переверните мини-ракон и поместите его в новую индивидуальную пробирку для повышения нефтеотдачи.

После вращения в течение двух минут при температуре 1000 G и четырех градусах Цельсия ядерный экстракт с высоким содержанием соли будет концентрирован примерно до 115 микролитров. Теперь переведите 45 микролитров аликвот ядерного экстракта с высоким содержанием солей в мини-диализные СЛИ. Убедитесь, что нижняя часть предметного стекла находится с нижней частью поплавка.

Затем поместите СЛИ в 500 миллилитров охлажденного диализного буфера. Наконец, перемешивайте аликвоты в течение одного-двух часов при температуре четыре градуса Цельсия, ядерный экстракт после диализа будет выглядеть мутным. На этом рисунке представлены репрезентативные данные, сравнивающие реакцию транскрипции и среза двух сопряженных РНК-полимераз в мелкомасштабном ядерном экстракте и в объемном ядерном экстракте.

Когда конструкцию A-C-M-V-D-N-A инкубировали в объемных или мелкомасштабных экстрактах, аналогичные уровни зарождающейся преРНК синтезировали в течение пяти минут после добавления альфа и манина для блокирования дальнейшей транскрипции, промежуточные продукты сплайсинга и продукты сплайсинга накапливались с течением времени с одинаковой кинетикой в обоих типах экстрактов. Эти репрезентативные результаты подтверждают, что эффективность системы транскрипции и сплайсинга на основе сопряженной РНК-полимеразы 2 одинакова в объемных и мелкомасштабных ядерных экстрактах. Чтобы продемонстрировать полезность мелкомасштабного экстракта, метод получали экстракты из клеток hela, обработанных ингибитором сплайсинга E 7 1 0 7 или отрицательным контрольным соединением Platy analy F, а затем проводили транскрипцию и анализ сплайсинга со связанной РНК-полимеразой 2, как показано на этом рисунке. Транскрипция РНК-полимеразой 2 происходила эффективно в экстрактах, полученных из обработанных plaid F и E 7 1 0 7 Клетки.

Напротив, сплайсинг происходил нормально в экстракте, полученном из клеток, обработанных анализом F, но был отменен в клетках, обработанных E 7 1 0 7. Эти данные являются доказательством концепции использования маломасштабных ядерных экстрактов для специальной обработки клеток в малых масштабах. После освоения этой техники ее можно освоить менее чем за пять часов.