Обратной генетики опосредованного восстановления инфекционных мышей норовирус

Общая цель этой процедуры заключается в восстановлении инфекционного нейровируса глаза с использованием двух обратных генетических систем. Здравствуйте, я Армандо Ариас из секции вирусологии в Имперском колледже Лондона. В нашей группе мы заинтересованы в анализе молекулярных механизмов, лежащих в основе репликации нейровирусов.

Норовирусы являются основной причиной гастроэнтерита. Мировые струйные молекулярные методы для их характеристики все еще относительно новы. Идентификация неопротивовирусных подходов и понимание жизненного цикла нейровируса были ограничены из-за их неспособности завершить продуктивную инфекцию в клеточной культуре.

Недавнее выделение противовирусных препаратов, способных заражать мышей и размножать клеточную культуру, а именно зеркального нейровируса, открыло новые возможности для исследования этих важных патогенов. В этом отчете мы продемонстрируем две стратегии, которые позволяют создавать генетически определенные изоляты нейронейровирусов в клеточной культуре. Обе стратегии основаны на генерации вирусных транскриптов, ограниченных пятью простыми концами.

Первый включает в себя синтез вирусной РНК in vitro при кэппинге перед трансфекцией в клетки. Второй подход включает в себя транскрипцию нейрофлакона ИМ, КДНК внутри клеток, экспрессирующих Т-7 РНК-полимеразу. Протокол восстановления нейроноровируса из кэпированных транскриптов РНК инициируется линейным подъемом.

Плазмида, содержащая MV CD NA для mmv one. Это делается с помощью фермента рестрикции NHE one. Затем ДНК транскрибируется in vitro в РНК с использованием Т-7 РНК-полимеразы.

Впоследствии M-M-V-R-N-A кэпируется in vitro и трансфицируется в клетки, чтобы обеспечить восстановление инфекционного MMV прямого восстановления инфекционного MNV с использованием вируса FAL PX, экспрессирующего Т-7 РНК-полимеразу, для восстановления MMV из непосредственно трансфицированных клонов кДНК, клетки сначала инфицируются рекомбинантным вирусом FAL PX, экспрессирующим Т-7 РНК-полимеразу FAL PX, инфекция приводит к экспрессии Т-7 РНК-полимеразы, а также вирусной РНК. кэппинг-ферменты, которые могут кэпировать некоторые из синтезированных РНК. Затем M-M-V-C-D-N-A трансфицируется в инфицированные FPV клетки путем липидно-опосредованной трансфекции. Затем Т-7 РНК-полимераза продуцирует M-M-V-R-N-A, некоторые из которых затем могут быть покрыты с помощью оборудования для укупорки F-P-V-R-N-A.

Последовательность рибо-зима гарантирует, что каждый транскрипт РНК содержит определенные три простых конца. Затем ограниченные транскрипты MMV будут транслироваться в белок перед репликацией, что приведет к образованию новых инфекционных частиц. Протокол транскрипции и кэппинга РНК для восстановления инфекционного синтеза MMV транскриптов с инфекционным колпачком MMV.

Во-первых, смешайте следующие реагенты, транскрипцию, буферные нуклеотиды, воду и линеаризованную плазмиду, содержащую M-M-V-C-D-N-A. Затем добавьте в реакционную смесь РНК и Т семь РНК-полимеразы. Для этой цели доступно множество коммерческих наборов, которые обеспечивают воспроизводимый метод синтеза РНК.

Реакцию транскрипции проводят путем инкубации смеси при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее двух часов. Проанализируйте небольшой алькотт этой транскрипционной реакции на неденатурирующем геле агрос. Сначала очистите гелевое оборудование с помощью моющего средства и промойте водой, не содержащей РНК, перед использованием.

Следите за тем, чтобы агросгели готовились с использованием РНК без реагентов. M-V-R-N-A будет работать примерно на трех киллерных базах на неденатурирующем геле агро-розы. Кроме того, биоанализатор Agilent может быть использован для быстрого анализа целостности РНК.

Затем РНК следует очистить для удаления неинкорпорированных нуклеотидов. Доступно множество методов, однако в этом протоколе мы очищаем РНК осаждением хлорида лития в качестве экономически эффективной альтернативы гранулированию РНК методом центрифугирования на максимальной скорости в течение 15 минут. Удалите надосадочную жидкость, стараясь не потревожить полупрозрачную гранулу, и промойте с использованием 70% этанола.

Повторно суспендируйте транскрипт MMV в растворе для хранения РНК и убедитесь, что он полностью растворен. Нагревание РНК до 65 градусов Цельсия может помочь этому процессу в дальнейшем. Количественное определение РНК с помощью спектрометрии.

Проанализируйте целостность РНК, нанеся небольшую аликвоту на 1%-ный неденатурирующий агрос-гель. Как вы можете видеть, целостность РНК после осаждения хлорида лития должна оставаться прежней для повышения эффективности укупорки. Нагрейте аликвоту РНК при температуре 65 градусов в течение 10 минут.

Поместите трубку сразу на лед. Во избежание деградации или повторного складывания приготовьте укупорочную реакционную смесь в соответствии с рекомендациями производителя. Обычно мы добавляем около 60 микрограммов M-N-V-R-N-A в конечную реакцию объемом 100 микролитров.

Хотя реакцию можно уменьшить, тщательно перемешать и инкубировать при 37 градусах в течение одного часа, очистить РНК осаждением хлорида лития, как и раньше. Прежде чем приступать к трансфекции, необходимо еще раз проверить целостность РНК. Ступенчатый протокол восстановления MMV путем электропорации РНК в исходные клетки. Ресус.

Суспендируйте колбу с сырыми клетками в DMEM. Убедитесь, что вы сформировали суспензию из одной клетки. Определить концентрацию жизнеспособных клеток в цитометре гемоцитометра с помощью трианового синего исключения.

Гранулируйте клетки и тщательно восстановите. Суспендируйте их в свежих средах без антибиотиков в объеме 8 миллионов клеток за трансфекцию и гранулируйте их в микрофуге. Удалите среду и промойте клетки в 500 микролитрах центрифуги PBS еще раз и удалите PBS для ресуспендирования клеток при комнатной температуре 130 микролитров.

Неоновый ресуспензионный раствор. Добавьте соответствующее количество ограниченной РНК, обычно 1,3 микрограмма на 130 микролитров клеток, что эквивалентно одному микрограмму РНК на 6 миллионов клеток. Клетки, смешанные с транскриптами, собираются в 100 микролитров неонового наконечника для трансфекции.

Следует проявлять большую осторожность, чтобы не занести пузыри на этом этапе. Затем электро работают с помощью одного импульса при напряжении 1700 вольт в течение 25 миллисекунд. Выпустите клетки в пробирку, содержащую один мил среды, не содержащей антибиотиков.

Распределите клетки из пробирки в независимые лунки, содержащие безантибиотиковый DMEM с 10% FCS, инкубируйте клетки при температуре 37 градусов в течение 24–72 часов. Восстановление MMV путем перфекции губы РНК в BSR T семь клеток, как и до CAP, транскрипты MMV генерируются с помощью MMV CD NNA plasmid LINEARIZATION T семь полимераз in vitro транскрипция и каппинг in vitro транскрипты затем поражаются губами в семь клеток BS RT. Трипсин представляет собой монослой из семи клеток bsrt и семян в 7,5 умножить на 10 к пяти жизнеспособным клеткам в шести луночных тарелках.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов на ночь. Удалите среду из клеток и замените ее тремя милами свежей среды, в которой отсутствуют антибиотики. Чтобы обеспечить максимальную эффективность трансфекции, смешайте один-два микрограмма крышки M-M-V-R-N-A со 100 микролитрами оптимальной.

Также смешайте четыре микролитра липэктомии 2000 со 100 микролитрами оптимально. Объедините образцы, содержащие РНК и липэктомию, и тщательно перемешайте их, пипетируя вверх и вниз 15 раз. Оставьте смесь при комнатной температуре на 20 минут.

Затем добавьте к монослою клетки трансфекционные комплексы, содержащие ограниченные транскрипты MMV, по сниженной цене. Встряхните пластину в перпендикулярных направлениях. Инкубируйте клетки от 24 до семи по два часа.

Протокол прямого восстановления инфекционного MMV из CDNA в клетках, экспрессирующих Т-7 РНК-полимеразу, как описано ранее. Этот протокол основан на экспрессии Т-7 РНК-полимеразы и вирусных ферментов oxx в клетках, инфицированных с помощью вируса oxx. Затем M-N-V-C-D-N-A под контролем промотора Т-7 затем трансфицируется в клетки.

Во-первых, удалите питательные среды для клеточных клеток и добавьте в каждую лунку по 700 микролитров вируса F-оспы, разведенного в средах, не содержащих антибиотиков. Обычно используется кратность инфекции около 0,5 БОЕ на клетку, формируют планшеты перпендикулярно и инкубируют в течение одного часа при температуре 37 градусов. Впоследствии. Добавьте два приема пищи в среду, не содержащую антибиотиков, и инкубируйте клетки в течение дополнительного часа при температуре 37 градусов, чтобы обеспечить трансфекцию Т-7 РНК-полимеразы MNV CG NNA, удалите среду из инфицированных клеток и добавьте три милли свежей среды без антибиотиков.

Приготовьте смесь из одного микрограмма M-M-V-C-D-N-A и липэктомии, как описано в предыдущем разделе. Тщательно перемешайте, подготавливая вверх и вниз. Подержите трубку при комнатной температуре 20 минут, затем еще раз перемешайте и добавьте в ячейку монослой капли пирогов.

Осторожно встряхните тарелку в перпендикулярных направлениях. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов в течение 24-72 часов, чтобы подтвердить выздоровление инфекционного MMV с помощью различных подходов обратной генетики, показанных в этом видео, высвобождать инфекционные вариации из клеток путем многократного замораживания и размораживания. Определите содержание в каждом образце с помощью стандартных процедур, таких как TCID 50 или репрезентативные результаты анализа бляшек.

Доступность этих обратных генетических систем для изучения нейровируса обеспечила беспрецедентную возможность проанализировать роль вирусных последовательностей в репликации и патогенезе нейровируса в естественном организме хозяина. Оба подхода обратной генетики, описанные в этом видео, очень эффективны для восстановления инфекционных нейровирусов и нейровирусов, а также клеточных культур. Как показано на этом рисунке.

Инфекционный MMV, название которого превышает от 10 до пяти TCID 50 на мил восстанавливаются после трансфекции закрытых транскриптов MM V либо в сырые клетки, либо в семь клеток BS RT. Трансфекция ММ V-C-D-N-A в семь клеток BSRT, ранее инфицированных с помощью вируса Foul Pops, приводит к тому, что титры вируса превышают от 10 до четырех TCID 50 промилле. Титры вирусов, полученные с помощью подходов обратной генетики, аналогичны титру, спасенному в трансфекте РНК, выделенному из инфекционного вируса, что подчеркивает высокую эффективность описанных здесь обратных генетических систем.