Всеобъемлющее Профилирование Допамин регулирование в черной субстанции и вентральной области покрышки

Общая цель данной процедуры заключается в максимизации информативности молекулярных показателей, связанных с регуляцией дофамина, при использовании одного образца ткани, выделенного из соматодендритных областей среднего мозга. Это достигается путем проведения точного препарирования для отделения черной субстанции от вентральной сегментарной области. Вторым этапом является обработка тканей для анализа содержания дофамина методом ВЭЖХ и последующая обработка осажденного эндогенного белка для проведения анализа.

Затем обработка осажденного белка для определения общего содержания белка позволяет установить, какие дофамин-регулирующие белки или фосфорилирование белков могут быть измерены совместно с определением содержания дофамина в ткани образца. В конечном итоге анализ дофамина и его регулирующих белков в отдельных соматодендритных областях среднего мозга позволяет сделать выводы о молекулярных механизмах, связанных с регуляцией дофамина.

Моноамины влияют на многие поведенческие показатели, и исследователи в области зависимостей, биологии и двигательных нарушений, в частности при болезни Паркинсона, крайне заинтересованы в том, как моноамины, такие как дофамин, который изучают в моей лаборатории, влияют на эти показатели. Однако значимость изучения моноаминов возрастает, если мы понимаем, как они регулируются на молекулярном уровне. Преимущество нашего метода заключается в том, что из одного образца, полученного из тканей ЦНС, можно получить несколько различных показателей, что позволяет полностью оценить, как молекулярные события влияют на дисрегуляцию моноаминов.

Эти данные можно использовать для анализа того, как будет изменяться поведение. Как правило, специалисты, впервые применяющие этот метод, сталкиваются с трудностями, поскольку определение количества белка и степени фосфорилирования требуют понимания того, сколько общего белка потребуется для получения точного результата в зависимости от антител, выбранных исследователем. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение.

Методы диссекции и определение средней концентрации мономеров с регулирующими белками представляют собой относительно новый подход к анализу регуляции in vivo. Для начала данной процедуры охладите матрикс мозга грызуна, чашку Петри с пятью лезвиями и скальпелем № 11 на слое мокрого льда. Также предварительно охладите на сухом льду столько пробирок, сколько потребуется для проведения диссекции.

Затем после жертвования крысы извлеките мозг и поместите его перевернутым таким образом, чтобы латеральные части мозжечка плотно прилегали к выемкам в ледяной матрице. Через минуту вставьте холодные лезвия бритвы в охлажденный мозг, начиная примерно с двух миллиметров ростральнее зрительного перекреста для анализа стриатума и прилежащего ядра. Продолжайте вставлять холодные лезвия бритвы через каждые один миллиметр до середины моста; при этом смещайте положение каждого лезвия, чтобы облегчить их последующее извлечение из матрицы.

При извлечении лезвий ориентируйтесь по началу гиппокампа, так как он служит лучшим указателем для поиска SN и VTA в месте, где гиппокамп полностью охватывает средний мозг. Сначала сделайте срезы скальпелем с лезвием № 11, чтобы отделить SN от VTA. Удалите вышележащую кору и гиппокамп.

Затем сделайте вертикальный разрез, отделяющий пигментированную область SN от VTA, следя за тем, чтобы лезвие постоянно контактировало с влажным льдом во время диссекции. Далее сделайте горизонтальный разрез по средней линии или рядом с ней, чуть выше дорсальной и латеральной частей SN. Наконец, аккуратно отделите SN от остальной части ствола мозга.

После удаления SN осторожно отделите VTA от остальной части среднего мозга. Немедленно поместите препарированные ткани в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки. Затем храните ткани при температуре -80 °C до начала их обработки.

В данной процедуре осторожно гомогенизируйте ткань сразу после извлечения из сухого льда, используя ледяной 0,1 молярный раствор хлорной кислоты с ЭДТА. После этого снова поместите образец на сухой лед. Затем центрифугируйте образцы при 12 000 об/мин для осаждения.

Осадок белка, который будет использован для вестерн-блоттинга, следует разделить, аспирировав супернатанты в пробирки для ВЭЖХ. Поместите все еще замороженные осадки преципитированного белка, полученные после обработки буфером для ВЭЖХ, на лед для размораживания, предварительно убедившись, что весь буфер удален и заархивирован. Для двусторонней обработки SN добавьте к осадку 300 µL 1% SDS, содержащего 5 mM Tris и 1 mM EDTA, и подвергните воздействию ультразвука; для двусторонней обработки VTA будет достаточно 200 µL 1% SDS.

Затем поместите образцы в кипящую воду примерно на пять минут для завершения денатурации белков. После этого дайте им остыть до комнатной температуры, убедившись на этом этапе, что крышки плотно закрыты. Затем проведите анализ BCA, используя стандартную кривую концентрации белка в диапазоне от 2 до 40 µg белка.

Для определения концентрации белка в образцах объемом 5 µL используйте медианное значение, полученное в результате анализа в трех повторностях, чтобы определить количество белка по стандартному графику. Разделите полученный результат на объем образца для вычисления концентрации белка. После этого, при необходимости (о чем свидетельствует цвет буфера для образцов), подготовьте образцы с использованием буфера для образцов, содержащего 2-меркаптоэтанол, для проведения восстанавливающего электрофореза в ПААГ с 10% акриламидом.

Дождитесь изменения цвета на желтый, затем добавляйте 1 M tris base pH 8.2 к образцу порциями по 10 µL до появления синего окрашивания. Для проверки правильности значения pH проведите электрофорез соответствующего количества общего белка в SDS-PAGE на 10% акриламидном геле, затем перенесите белки на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм. Настройте камеру Хоффера на напряжение не менее 27 В и оставьте систему для переноса белков на ночь.

На следующий день высушите блот в течение не менее 30 минут. Затем окрасьте его раствором понсо S (ponceau S) примерно в течение пяти минут. После этого интенсивно промывайте его 0,2% раствором соляной кислоты до тех пор, пока отдельные полосы белков не станут четко различимы, а фоновое окрашивание не исчезнет.

Затем получите изображение окрашивания понзо S с помощью ImageJ, чтобы количественно определить относительную нагрузку белка в каждой дорожке и нормализовать результаты для тирозингидроксилазы, транспортера дофамина или везикулярного транспортера моноаминов 2. Здесь представлен вестерн-блот антител Syrian 31 к фосфорилированной тирозингидроксилазе в образцах черной субстанции крысы. Калиброванная стандартная кривая антител Syrian 31 к фосфорилированной тирозингидроксилазе охватывает диапазон от 0.3 nanograms до 2.0 nanograms и находится в пределах линейного диапазона детектирования. Здесь представлен вестерн-блот антител Syrian 40 к фосфорилированной тирозингидроксилазе в образцах вентральной области покрышки крысы.

Калиброванная стандартная кривая SN 40 для фосфорилированной тирозингидроксилазы охватывает диапазон от 0.2 nanograms до 1.5 nanograms и находится в пределах линейного диапазона детекции. Важно соблюдать надлежащий температурный режим, а также правильно маркировать пробирки. Также необходимо провести нормализацию белка для снижения вариабельности ваших результатов.

При строгом соблюдении данного протокола исследователи в области локомоторных функций и аддиктивного поведения смогут получить обширные молекулярные данные о регуляции моноаминов в мозге, в частности дофамина, что представляет основной интерес. Эти данные позволяют провести детальный и тщательный анализ их влияния на поведенческие результаты. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как максимально увеличить объем данных о регуляции моноаминов в черной субстанции и вентральной области покрышки при однократном выделении ткани.