Простой протокол для извлечения Гемоциты от диких гусениц

Общая цель этой процедуры заключается в извлечении, визуализации и подсчете цитов диких гусениц. Это достигается путем обезболивания гусеницы путем помещения ее на лед, введения ей буферного раствора, содержащего антикоагулянт, и возвращения гусеницы на лед, чтобы позволить цитам снова войти в кровообращение перед экстракцией. Второй шаг – сделать неглубокий надрез на заднем конце гусеницы с помощью чистого скальпеля.

Далее гусеницу аккуратно сжимают с помощью мягких щипцов. Затем буферный раствор гемолимфатической смеси отсасывают с помощью микропипетки и собирают в микроцентрифужную пробирку. Заключительным этапом является аккуратное смешивание раствора гемолимфы с равным объемом буферного раствора и перенос 10 микролитров раствора на цитометр гемоцита для визуализации и подсчета количества цитов.

В конечном счете, этот метод экстракции гемоцитов может быть использован в качестве быстрого и эффективного метода подсчета цитов различных видов гусениц и использоваться в качестве инструмента для изучения физиологических аспектов клеточного иммунного ответа насекомых. Основное преимущество этой методики заключается в том, что с ее помощью можно извлекать гемосоты из гусениц с сильно сниженным проксом. Другие модели гусениц обескровливаются путем разрезания одного из плюсов, без извлечения цитатов из выходящей жидкости.

Кроме того, этот метод может быть использован для извлечения гемотипа из других видов насекомых. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в области экоиммунологии, например, как клеточный иммунный ответ насекомых меняется в зависимости от качества рациона, стадии развития или воздействия различных патогенов. Чтобы начать эту процедуру, обезболите личинки предпоследнего возраста, охладив их на льду в течение 20 минут перед экстракцией гемоцитов.

После этого вставьте тупой конец чистой капиллярной иглы 16 калибра в трубку, которая подсоединена к стеклянному шприцу объемом 20 миллилитров. Оставьте пробирку с раствором для сбора открытой на лабораторном столе. Медленно заполните капилляр примерно 10-15 микролитрами буфера.

Затем упритесь иглой в шарик из глины, который помещается рядом с препарирующим микроскопом. Поместите гусеницу в чашку Петри. Насекомое следует расположить на боку так, чтобы сферики были хорошо видны.

Рассматривая под препарирующим микроскопом, удерживайте гусеницу на месте с помощью щипцов и поместите иглу близко к одному из сферических участков, где кутикула насекомого обычно мягче. Затем аккуратно прижмите капиллярную иглу к телу насекомого. Как только игла проникнет в кутикулу, введите весь объем раствора в гусеницу.

Тело гусеницы будет разбухать после укола, но оно не должно лопаться или сочиться. Верните гусеницу в ледяную чашку Петри. Расположите насекомое дорсально, чтобы буфер не вытекал из раны.

Повторите инъекции для каждой гусеницы, используемой для экстракции hemo limp. Затем дайте всем насекомым остыть на льду в течение 30 минут. Теперь поместите гусеницу в чашку Петри под препарирующий микроскоп.

Аккуратно сделайте неглубокий надрез длиной около двух-трех миллиметров в задней области гусеницы, используя стерильный скальпель, не повреждая кишечник или другие внутренние органы. Затем осторожно сожмите гусеницу с помощью пары гибких пластиковых щипцов, собирая примерно от 10 до 20 микролитров смеси hemo limp с помощью наконечника пипетки объемом 10 микролитров. Опять же, будьте осторожны, чтобы не травмировать внутренние ткани.

После этого отбраковывают остатки гусениц. Соберите hemo limp от каждой гусеницы в отдельные маркированные силиконизированные, 0,5 миллилитровые микроцентрифужные пробирки. Затем добавьте примерно от 10 до 20 микролитров инкубационного раствора в каждый образец hemo limp, собранный от отдельной гусеницы.

На этом этапе образцы гемолимфы всегда держите на льду. Смешайте образец гемолимфы и инкубационный раствор непосредственно перед подсчетом. Он цитирует.

Такая обработка позволяет обеспечить правильное разделение цитатов и предотвращает образование комков. С помощью чистого наконечника пипетки перенесите 10 микролитров образца гемолимфы, смешанного с инкубационным раствором, на гемоцитометр. Затем с помощью составного микроскопа подсчитывают и записывают количество цитов не менее чем в 15 больших квадратах центральной сетки гемоцитометра.

Сложите эти значения, чтобы получить общую сумму количества гемоцитов в 15 квадратах. Далее тщательно промойте гемоцитометр и его крышку предметного стекла с помощью промывочной бутылки с дистиллированной и деионизированной водой. Затем вытрите его насухо салфетками Ким.

Повторите процедуры для остальных образцов hemo limp и рассчитайте среднее количество гемоцитов на миллилитр объема hemo limp для каждой гусеницы. На снимке светлопольной микроскопии показаны выделенные циты из гусениц ядра hin ai при 20-кратном увеличении. После этой процедуры собранные гемоциты могут быть использованы для изучения клеточного иммунного ответа и проведения таких анализов, как фагоцитоз и кап, выбор инкапсуляции и активность рН-оксидазы.

Кроме того, R-N-A-D-N-A и белок могут быть собраны неиспользованными для дальнейших анализов с целью изучения этих клеточных иммунных реакций у насекомых. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как вводить гусеницам с целью извлечения гемолимфы и как собирать гемолимфу, содержащую живые гемоциты.