Модифицированного метода EPA 1623, в котором используются Тангенциальный поток полые волокна ультрафильтрации и тепловой диссоциации шаги для обнаружения водной основе

Общая цель данной процедуры заключается в обнаружении и визуализации видов cryptosporidium и giardia, передающихся через воду. Это достигается путем предварительного концентрирования пробы воды с использованием ультрафильтрации через полые волокна с тангенциальным потоком. На втором этапе осуществляется элюирование организмов и удаление остаточного мусора с фильтра после стадии центрифугирования.

Иммуномагнитная сепарация позволяет селективно отделять паразитов от концентрированного клеточного дебриса. Магнитные бусины отделяют от паразитов путем тепловой диссоциации и удаляют с помощью магнита. Затем цисты и О-цисты помещают на предметное стекло, и образец окрашивают для визуализации методом иммунофлуоресцентной микроскопии.

Главное преимущество фильтрации hofi по сравнению с существующими методами заключается в том, что ультрафильтр значительно дешевле и улавливает множество микроорганизмов, помимо Cryptosporidium и Giardia, включая вирусы и бактерии. Как правило, специалисты, начинающие работать с иммуносепарацией, могут столкнуться с трудностями из-за количества и типа примесей, характерных для различных образцов, полученных при разных климатических условиях. Начните со сборки установки для ультрафильтрации внутри бокса биологической безопасности.

После сборки аппарат функционирует следующим образом: проба воды поступает в систему через черный Т-образный соединитель, проходит через головку насоса, манометр и попадает в половолоконный ультрафильтр; отфильтрованная вода выходит из боковой части фильтра в контейнер для отходов. Удерживаемая вода с организмами вытесняется в бутыль с ретентатом и рециркулирует по системе до тех пор, пока объем воды не уменьшится. Чтобы начать процедуру, снимите вентиляционную крышку и откройте все зажимы, кроме зажима два, который должен быть закрыт, чтобы бутыль с ретентатом могла наполниться водой; установите направление работы насоса так, чтобы проба воды текла в фильтр.

Затем установите скорость насоса на 25% и включите его, когда флакон с ренатом будет заполнен на две трети. Пережмите зажим номер два и быстро плотно закройте флакон с помощью вентиляционной крышки. Проверьте все линии и соединения, чтобы убедиться в отсутствии утечек.

Затем медленно увеличьте скорость работы насоса примерно до 1,5 liters per minute, используя мерный цилиндр и таймер или расходомер, и убедитесь, что скорость фильтрации — скорость выхода воды из линии эффлюента — действительно составляет 1,5 liters per minute. Контролируйте процесс фильтрации, следя за тем, чтобы бутыль с ретентатом не опустела, хотя ее объем может незначительно изменяться. Если объем упадет ниже одной трети, снимите вентиляционную крышку и закройте зажим два.

Снова дождитесь, пока объем жидкости в бутылке увеличится до двух третей. Затем плотно закройте вентиляционную крышку и снова откройте зажим два. Как только контейнер с образцом опустеет, немедленно закройте прижимной зажим один и снизьте скорость насоса до 20%. Снимите вентиляционную крышку с бутылки для ретентата и закройте зажим, соединяющий трубку слива фильтр-колонки с резервуаром для отходов.

Затяните или ослабьте зажим рампы, чтобы отрегулировать объем в бутылке с ретентатом примерно до 200 мл. Затем затяните зажим рампы для элюента, чтобы элюировать образец. Сначала добавьте 500 мл раствора элюента в контейнер для образца, промывая при этом внутреннюю поверхность контейнера.

Затем поместите 10-миллилитровую пипетку, подключенную к линии забора пробы, в контейнер с элюирующим раствором. Откройте зажим один и на мгновение закройте зажим два, чтобы забрать элюирующий раствор. После того как весь раствор будет загружен, закройте зажим один, откройте зажим два и дайте раствору циркулировать в течение пяти минут при скорости насоса 20%. Затяните или ослабьте зажим рампы, чтобы отрегулировать объем пробы в бутылке с ренатом примерно до 100 миллилитров.

Затем полностью затяните зажим пандуса и дайте образцу рециркулировать в течение одной минуты. После этого измените направление работы насоса на 20 секунд. Это приведет к накоплению примерно 225 мл образца в бутыли Тейта.

Затем выключите насос. Снимите трубки с головки насоса и трубку на выходе из фильтра, удерживая их над бутылью Тейта, чтобы вытеснить остатки образца в бутыль. Затем отсоедините все трубки от бутыли и замените вентиляционную крышку на герметичную.

Перенесите концентрированный образец в коническую центрифужную пробирку объемом 250 milliliter. Дважды промойте флакон из-под образца 10 milliliters реагентной воды и перенесите промывочную жидкость в центрифужную пробирку. Центрифугируйте образец при ускорении не менее 1500 ×g в течение 15 минут.

Не используйте функцию торможения для остановки центрифугирования. После завершения центрифугирования осторожно аспирируйте супернатант, оставив пять миллилитров над осадком. Следует проявлять особую осторожность, чтобы оставаться у верхнего уровня жидкости и не аспирировать О-цисты и цисты, находящиеся в осадке.

Перемешайте содержимое пробирки на вортексе до полного ресуспендирования осадка. Затем перенесите образец в пробирку Dial L 10 с плоским дном, содержащую по 1 мл 10 X буфера A и буфера B. Дважды промойте центрифужную пробирку 2,5 мл реагентной воды и добавьте раствор для промывки в пробирку Dial L 10. Доведите конечный объем до 12 мл, добавив в пробирку по 100 µL конъюгированных с магнитными частицами антител к Cryptosporidium и Giardia.

Затем поместите пробирку на ротационный миксер и вращайте ее со скоростью 18 RPM в течение одного часа при комнатной температуре. Приложите плоскую сторону пробирки к магниту MP six и аккуратно покачивайте пробирку в течение двух минут, не отделяя ее от магнита. Удерживая пробирку плоской стороной вверх, слейте супернатант.

Осторожно, чтобы не потревожить гранулы, удерживаемые на плоской стороне пробирки рядом с магнитом, извлеките пробирку с образцом из магнита и трижды промойте плоскую сторону пробирки 500 µL буфера A, избегая соприкосновения с осадком на круглой стороне пробирки. Перенесите каждый объем промывочного раствора в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл, помещенную в магнит MPCS.

При вертикальном положении магнита закройте пробирку и осторожно перемешивайте ее качающими движениями в течение одной минуты. Затем, не убирая магнит, аспирируйте супернатант с помощью пипетки Пастера, опущенной до дна пробирки, и осторожно добавьте в пробирку 1 mL PBS.

Следите за тем, чтобы не потревожить осадок магнитных частиц. Прикрепите пробирку к стенке рядом с магнитом. Снимите магнитную полоску и осторожно покачивайте пробирку до полного ресуспендирования частиц.

Снова поместите магнитную полоску в вертикальное положение. Осторожно покачивайте пробирку в течение одной минуты и аспирируйте супернатант, удаляя как можно больше остатков материала, не затрагивая при этом гранулы. После этого этапа промывки уберите магнит и добавьте 50 µL реагентной воды непосредственно на осадок из гранул.

Перемешайте содержимое пробирки на вортексе на максимальной скорости в течение 50 секунд для ресуспендирования магнитных частиц. Затем инкубируйте образец при 80 °C в течение 10 минут, чтобы цисты Giardia и ооцисты Cryptosporidium отделились от магнитных частиц. После инкубации перемешайте образец на вортексе в течение 30 секунд. Затем поместите магнитную полоску в MPCS, используя наклонное положение, чтобы отделить магнитные частицы от цист и ооцист, находящихся в суспензии.

Перенесите супернатант, содержащий цисты и O-цисты, на предметное стекло с лунками. Повторите этапы добавления воды, перемешивания на вортексе и тепловой диссоциации второй раз, добавив супернатант на то же стекло. Затем поместите стекло на подогрев до 37 °C для высушивания суспензии.

Начните с нанесения 50 µL метанола на предметное стекло для фиксации образца и дайте ему высохнуть при комнатной температуре. Затем добавьте 50 µL раствора DPI и инкубируйте стекло в течение двух минут при комнатной температуре. Для окрашивания ядер используйте салфетку Kim wipe, чтобы аккуратно удалить излишки раствора из лунки, стараясь не касаться самой лунки.

Затем добавьте 50 µL красителя easy stain, чтобы окрасить клеточную стенку цист Giardia и цист Cryptosporidium o. Инкубируйте образец при 35 °C в течение 30 минут. Удалите излишки красителя салфеткой Kim wipe, как и раньше.

Затем медленно добавьте 300 µL холодного фиксирующего буфера easy stain, аккуратно поместив наконечник пипетки за пределы лунки и позволяя жидкости самостоятельно стечь в нее. Инкубируйте предметное стекло в течение двух минут при комнатной температуре. Затем удалите буфер с помощью салфетки Kimwipe и нанесите 10 µL среды для заключения; осторожно поместите покровное стекло на образец, удаляя все пузырьки воздуха, и зафиксируйте края покровного стекла прозрачным лаком для ногтей. С помощью флуоресцентного микроскопа исследуйте препарат при увеличении от 200x до 1000x, используя фильтр fse, затем фильтр DPI при увеличении 200x; цисты и ооцисты выглядят как ярко-зеленые флуоресцирующие овальные структуры с ярко выраженными краями.

Цисты Cryptosporidium O имеют округлую форму и размер от 4 до 6 мкм. Цисты Giardia крупнее, их ширина составляет от 5 до 15 мкм, а длина — от 8 до 18 мкм; при 1000-кратном увеличении они могут быть округлыми или овальными. При использовании фильтра DPI внутреннюю структуру цист и CYS можно рассмотреть более детально.

Обычно внутри Cryptosporidium O cys и Giardia Cys.DIC видны до четырех спорозоитов, ядра которых окрашены в голубой цвет красителем DPI. Микроскопия также может помочь в правильной идентификации паразитов, так как позволяют оценить дополнительные морфологические характеристики. Спорозоиты Cryptosporidium могут быть видны при дифференциально-интерференционном контрасте (DIC); цисты Giardia часто имеют одну или несколько различимых внутренних структур, таких как видимые ядра, серповидные органеллы, называемые срединными тельцами, и внутренние жгутиковые структуры, называемые аксонами.

Важно отметить, что процедура ультрафильтрации с использованием полых волокон позволяет улавливать множество различных микроорганизмов. Кроме того, к концентрированным образцам могут быть применены другие методы детекции, такие как QPCR и генотипирование, что делает данный метод более гибким и адаптируемым к вашим задачам. Благодарим за просмотр; если у вас возникли вопросы, пожалуйста, сообщите нам.