Ремонт критического размера дефекта свода черепа Модель Используя полученные из жировой ткани стромальных клеток, полученных из Lipoaspirate

Общая цель данной процедуры заключается в выделении мультипотентных стромальных клеток из жировой ткани для последующей остеогенной дифференцировки с использованием модели дефекта свода черепа in vivo у мыши. Это достигается путем первоначального выделения клеток-предшественников из стромально-васкулярной фракции жировой ткани, которая может быть получена после процедуры липосакции. Следующим этапом является подготовка трехмерного каркаса с последующим высевом клеток на этот скаффолд.

Заключительным этапом является создание критического дефекта свода черепа в модели крысы, в который помещают скаффолд и клетки. В конечном итоге результаты показывают, что мультипотентные стромальные клетки, выделенные из жировой ткани, обладают потенциалом для регенерации скелетных тканей in vivo. Данная методика имеет широкий спектр возможных клинических применений ввиду дефицита тканей, доступных для регенерации скелета.

Несмотря на то, что аутологичные костные трансплантаты являются золотым стандартом, этот метод ограничен недостатком донорских участков и заболеваемостью в месте забора материала. Могут использоваться аллотрансплантаты и инородные материалы, однако их применение ограничено высокой стоимостью, плохой интеграцией и риском развития инфекции.

Возможность использования жировой ткани для выделения клеток-предшественников для инженерии скелетных тканей открывает широкие перспективы. Демонстрацию процедуры проведу я и Майкл Чанг из лаборатории Long Anchor. Сначала получите образец подкожной жировой ткани человека, полученный в ходе плановых процедур липоаспирации.

Обратите внимание на два слоя в липоаспирате. Супернатант содержит подавляющее большинство клеточного материала, полученного в ходе процесса. Нижний слой состоит преимущественно из введенного физиологического раствора.

Стромальные клетки, полученные из жировой ткани, можно выделить из любого слоя, однако выход из супернатанта значительно выше. Для выделения стромально-васкулярной фракции (SVF) многократно промойте липоаспират равными объемами 1x фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 2,5% Betadine, затем аспирируйте равный объем 1x PBS без Betadine. Оставьте промытый материал для осаждения.

На протяжении всего процесса строго соблюдайте правила стерильности, чтобы избежать контаминации обработанной тканью человека. Затем аспирируйте нижний слой и удалите его после каждой промывки, после чего перенесите 15 миллилитров жировой ткани в конические пробирки Falcon объемом 50 миллилитров. Затем проведите переваривание жировой ткани в 15 миллилитрах фильтрованного 0,075% раствора.

Добавьте коллагеназу второго типа в сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) и инкубируйте при 37 °C на водяной бане в течение 60 минут при постоянном перемешивании, не забывая вентилировать пробирки каждые 15 минут. Затем нейтрализуйте активность фермента, добавив 15 мл PBS, содержащего 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и центрифугируйте. В результате получится осадок SVF высокой плотности, представляющий собой смесь мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани и эритроцитов.

Сначала удалите верхний жировой слой, затем осторожно слейте супернатант, не затрагивая осадок. Ресуспендируйте осадок в 10 миллилитрах традиционной ростовой среды. Затем объедините содержимое трех пробирок в одну чистую коническую пробирку объемом 50 миллилитров, используя фильтр с размером пор 100 микрон, и центрифугируйте.

Удалите супернатант, не повреждая осадок, а затем ресуспендируйте осадок. В пяти миллилитрах стандартной питательной среды объедините содержимое двух конических пробирок объемом 50 мл на одну чашку диаметром 10 см или пяти конических пробирок объемом 5 мл на одну чашку диаметром 15 см. Инкубируйте первичные культуры в течение ночи при 37 °C в атмосфере с 21% oxygen и 5% carbon dioxide.

После инкубации в течение ночи промойте планшеты раствором PBS, чтобы удалить остатки неадгезивных эритроцитов. Полученные популяции клеток представляют собой стромальные клетки, полученные из жировой ткани. Поддерживайте клетки на субконфлюэнтном уровне, чтобы предотвратить спонтанную дифференцировку.

При 37 °C, 21% oxygen и 5% carbon dioxide. При культивировании в ростовой среде клетки обычно необходимо пересевать каждые три-четыре дня в свежую ростовую среду. При достижении 50% конфлюэнтности при посеве подготовьте скаффолд согласно описанию в сопроводительной рукописи.

Когда клетки достигнут уровня субконфлюэнтности, дважды промойте их раствором PBS и обработайте трипсином. Подсчитайте количество клеток для их количественного определения. Для посева подготовьте скаффолды диаметром 4 мм, предварительно вырезанные по размеру, и засейте их клетками в количестве 1,5 × 10⁵.

Поместите отдельный скаффолд в одну лунку 96-луночного планшета, затем ресуспендируйте клетки в обычной ростовой среде с концентрацией примерно 1,5 × 10⁵ клеток на 20 µL среды. Засейте скаффолд, перенеся 20 µL раствора непосредственно на него с помощью пипетки, и поместите планшет в инкубатор для культур клеток на 30 минут.

Через 30 минут добавьте 200 µL среды и оставьте клетки инкубироваться на скаффолде на ночь. Перед операцией нет необходимости проверять адгезию клеток к скаффолду после посева. Достаточного количества клеток будет достаточно для того, чтобы большая их часть прикрепилась к скаффолду.

После проведения анестезии взрослой мыши линии CD-1 nude в возрасте 60 дней трижды стерилизуйте место хирургического вмешательства раствором бетадина и спиртом, затем нанесите лубрикант на глаза животного. Выполните срединный сагиттальный разрез кожи головы мыши, чтобы обнажить правую теменную кость. Удалите надкостницу с правой теменной кости методом тупого соскабливания.

Затем создайте односторонний полнослойный дефект размером 4 мм в правой теменной кости вне области швов. Используя сверло с алмазным напылением, будьте предельно осторожны, чтобы не повредить подлежащую твердую мозговую оболочку, так как толщина свода черепа мыши до имплантации составляет менее 0,3 мм. Промойте скаффолды стерильным PBS, чтобы предотвратить перенос факторов роста из среды.

Поместите скаффолд в область дефекта. В завершение наложите швы на кожу и наблюдайте за животным в соответствии с установленными послеоперационными протоколами. Выполните микро-КТ мыши и получите 3D-реконструированное изображение с помощью программного обеспечения microview.

Используйте Adobe Photoshop, чтобы привести изображения к стандартной высоте. Как правило, измерения регенерации свода черепа проводятся каждые две недели. Во время сканирования для долгосрочного наблюдения мыши находятся под анестезией, а в конечном итоге подвергаются эвтаназии.

Для гистологического анализа используйте инструмент «волшебная палочка» для измерения количества пикселей в области дефекта свода черепа. Определяйте процент заживления дефекта по результатам последующего КТ-сканирования. Измерьте площадь дефекта свода черепа, определите количество пикселей и разделите его на количество пикселей исходного дефекта; окрасьте несколько срезов по всей протяженности дефекта с помощью гистологических красителей, таких как анилиновый синий и пентаро, для визуализации остеогенеза.

Используйте adobe Photoshop, чтобы обрезать все области, не относящиеся к дефекту свода черепа, и примените инструмент «Волшебная палочка», чтобы определить количество пикселей новообразованной костной ткани в области дефекта, после чего сравните полученные данные с контрольной группой или другими переменными. Здесь представлен обзор процесса забора и применения липоаспирата: от выделения стромальных клеток жировой ткани до их экспансии, дифференцировки и использования in vitro и in vivo. На данном микро-КТ снимке показано заживление критического дефекта свода черепа in vivo при применении ASC через гидроксиапатитовый скаффолд, представленный в нижнем ряду.

Контрольные образцы, представленные в верхнем ряду, включают группу без скаффолда и группу с дефектом. В среднем ряду показан дефект с установкой скаффолда без клеток. Здесь представлена количественная оценка костного заживления по данным микро-КТ (LS), которая демонстрирует значительно более выраженное заживление в группе A SC.

На данном гистологическом снимке показано усиленное формирование костной ткани в группе A SC с помощью андала. Синим цветом отмечено окрашивание AROM на al. При окрашивании pen arom остеоид окрашивается в темно-синий цвет.

Представленное здесь желтое окрашивание остеоида демонстрирует ASC человека, меченные GFP, которые были высеяны на скаффолд и зафиксированы через две недели. Окрашивание проводили с использованием антител, меченных GFP, чтобы показать вклад человеческих клеток в регенерацию в области дефекта. Здесь представлена иммунохимическая реакция на ядерный антиген человека, демонстрирующая преобладание человеческих клеток в области дефекта через две недели.

После освоения методики обработка жировой ткани может быть выполнена в течение четырех часов, а хирургическая процедура занимает около 10 минут на одну мышь. Важно помнить, что теменная кость имеет округлую форму, в то время как сверло — плоское, поэтому необходимо принять меры, чтобы полностью пройти по всей окружности четырехмиллиметрового дефекта. Помните, что сверлить нужно медленно, чтобы избежать повреждения твердой мозговой оболочки мозга.

После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как выделить клетки-предшественники из жировой ткани. Посейте эти клетки на скаффолд и имплантируйте их мыши.