Ремонт критического размера дефекта свода черепа Модель Используя полученные из жировой ткани стромальных клеток, полученных из Lipoaspirate

Общая цель данной процедуры заключается в получении мультипотентных стромальных клеток из жировой ткани для последующей остеогенной дифференцировки с использованием модели дефекта свода черепа in vivo у мыши. Это достигается путем первоначального выделения клеток-предшественников из стромально-васкулярной фракции жировой ткани, которая может быть получена после процедуры липосакции. Следующим этапом является подготовка трехмерного каркаса с последующим засевом клеток на этот скаффолд.

Заключительным этапом является создание критического дефекта свода черепа в модели крысы, в который помещают скаффолд и клетки. В конечном итоге результаты показывают, что мультипотентные стромальные клетки, выделенные из жировой ткани, обладают потенциалом для регенерации скелета in vivo. Данная методика имеет широкий спектр возможных клинических применений ввиду нехватки тканей, доступных для регенерации скелета.

Хотя аутологичная костная пластика считается золотым стандартом, отсутствие достаточного количества донорских участков и заболеваемость в области забора материала ограничивают применение данного метода. Могут использоваться аллографты и инородные материалы, однако их применение ограничено стоимостью, плохой интеграцией и риском развития инфекции.

Возможность использования жировой ткани для выделения клеток-предшественников для инженерии скелетных тканей открывает широкие перспективы. Демонстрацию процедуры проведу я и Майкл Чанг из лаборатории long anchor. Сначала получите образцы подкожной жировой ткани человека, полученные в ходе плановых процедур липоаспирации.

Обратите внимание на два слоя в липоаспирате. Супернатант содержит подавляющее большинство клеточного материала, полученного в процессе. Нижний слой состоит преимущественно из введенного физиологического раствора.

Стромальные клетки, полученные из жировой ткани, могут быть собраны из любого слоя, однако выход из супернатанта значительно выше. Для выделения стромально-васкулярной фракции или SVF тщательно промойте липоаспират равными объемами 1x фосфатно-солевого буферного раствора (PBS), содержащего 2,5% Betadine, затем аспирируйте равный объем 1x PBS без Betadine. Дайте промывке осадиться.

На протяжении всего процесса строго соблюдайте правила стерильности, чтобы избежать контаминации обработанной тканью человека. Затем аспирируйте нижний слой и удалите его после каждой промывки, затем перенесите 15 миллилитров жировой ткани в конические пробирки Falcon объемом 50 миллилитров. После этого проведите переваривание жировой ткани в 15 миллилитрах фильтрованного 0,075% раствора.

Инкубируйте коллагеназу второго типа в сбалансированном солевом растворе Хэнкса или HBSS при 37 °C на водяной бане в течение 60 минут при постоянном перемешивании, не забывая вентилировать пробирки каждые 15 минут. Затем нейтрализуйте активность фермента, добавив 15 мл PBS, содержащего 10% фетальной бычьей сыворотки или FBS, и центрифугируйте. В результате получится осадок SVF высокой плотности, который будет представлять собой смесь жировых стволовых клеток и эритроцитов.

Сначала снимите верхний слой жира, затем удалите супернатант, стараясь не задеть осадок. Ресуспендируйте осадок в 10 миллилитрах стандартной ростовой среды. Затем объедините содержимое трех пробирок в одной чистой конической пробирке объемом 50 миллилитров, используя фильтр 100 мкм, и центрифугируйте.

Удалите супернатант, не нарушая осадок, а затем ресуспендируйте осадок. В пяти миллилитрах стандартной питательной среды объедините содержимое двух конических пробирок объемом 50 мл на одну чашку диаметром 10 см или пяти конических пробирок объемом 5 мл на одну чашку диаметром 15 см. Инкубируйте первичные культуры в течение ночи при 37 °C в атмосфере с 21% oxygen и 5% carbon dioxide.

После инкубации в течение ночи промойте планшеты раствором PBS, чтобы удалить остатки неадгезивных эритроцитов. Полученные клеточные популяции представляют собой стромальные клетки, полученные из жировой ткани. Поддерживайте клетки на субконфлюэнтном уровне, чтобы предотвратить спонтанную дифференцировку.

При 37 °C, 21% кислорода и 5% углекислого газа. При культивировании в ростовой среде клетки обычно требуют пересева каждые три-четыре дня. При достижении 50% конфлюентности подготовьте скаффолд согласно описанию в прилагаемой рукописи.

Когда клетки достигнут уровней субконфлюэнтности, дважды промойте их PBS и проведите трипсинизацию. Подсчитайте количество клеток для их количественного определения. Для посева подготовьте предварительно вырезанные скаффолды диаметром 4 мм, используя 1,5 × 10⁵ клеток на каждый скаффолд.

Поместите один каркас в лунку планшета на 96 лунок, затем ресуспендируйте клетки в стандартной ростовой среде с концентрацией примерно 1,5 × 10⁵ клеток на 20 мкл среды. Засейте каркас, перенеся пипеткой 20 мкл суспензии непосредственно в каркас, и поместите его в инкубатор для культур клеток на 30 минут.

Через 30 минут добавьте 200 µL среды и оставьте клетки инкубироваться на скаффолде на ночь. Перед операцией нет необходимости проверять адгезию клеток к скаффолду после посева. Достаточное количество клеток обеспечит прикрепление большинства из них к скаффолду.

После проведения анестезии взрослой 60-дневной мыши линии CD-1 nude трежды стерилизуйте область хирургического вмешательства раствором бетадина и спиртом, затем нанесите смазочное средство на глаза мыши. После этого сделайте срединный сагиттальный разрез кожи головы мыши, чтобы обнажить правую теменную кость. Удалите надкостницу с правой теменной кости методом тупого соскабливания.

Затем создайте односторонний полнослойный дефект размером 4 мм в правой теменной кости в области, не связанной со швами. Используя сверло с алмазным напылением, будьте предельно осторожны, чтобы не повредить подлежащую твердую мозговую оболочку, так как толщина свода черепа мыши до имплантации составляет менее 0,3 мм. Промойте скаффолды стерильным PBS, чтобы предотвратить перенос факторов роста из питательной среды.

Поместите скаффолд в область дефекта. В завершение наложите швы на кожу и наблюдайте за животным в соответствии с установленными послеоперационными протоколами. Выполните микро-КТ мыши и получите 3D-реконструированное изображение с помощью программного обеспечения Microview.

Используйте Adobe Photoshop, чтобы привести изображения к стандартной высоте. Как правило, измерения регенерации свода черепа проводятся каждые две недели. Для долгосрочного наблюдения мыши подвергаются анестезии во время сканирования и в конечном итоге подвергаются эвтаназии.

Для гистологического анализа используйте инструмент «волшебная палочка» для измерения количества пикселей в области дефекта свода черепа. Определите процент заживления дефекта по результатам последующих КТ-сканирований. Измерьте площадь дефекта свода черепа, определите количество пикселей и разделите его на количество пикселей в исходном дефекте; окрасьте несколько срезов по всей длине дефекта с помощью гистологических красителей, таких как анилин синий и пензоро, для визуализации остеогенеза.

Используйте adobe Photoshop, чтобы обрезать все области, не относящиеся к дефекту свода черепа, и с помощью инструмента «Волшебная палочка» определите количество пикселей новообразованной костной ткани в области дефекта, после чего сравните эти данные с контрольной группой или другими переменными. Здесь представлен обзор процесса получения и применения липоаспирата: от изоляции стромальных клеток жировой ткани до их экспансии, дифференцировки и использования in vitro и in vivo. На данном микро-КТ снимке показано заживление критического дефекта свода черепа in vivo при применении ASC через гидроксиапатитовый скаффолд, представленный в нижнем ряду.

Контрольные группы, представленные в верхнем ряду, включают образцы без скаффолда и с дефектом. В среднем ряду показан дефект с установленным скаффолдом без клеток. Представленный здесь показатель LS является количественной оценкой костного заживления по данным микро-КТ, которая демонстрирует значительно более выраженное заживление в группе A SC.

На данном гистологическом изображении показано усиление остеогенеза в группе A SC при использовании andal. Синим цветом отмечено окрашивание AROM на al. При окрашивании pen arom остеоид окрашивается в темно-синий цвет.

Представленные здесь желто окрашенные участки остеоида — это ASC человека, меченные GFP, которые были высеяны на скаффолд; забор образцов производился через две недели. Окрашивание проводилось с использованием антител, меченных GFP, для демонстрации участия человеческих клеток в регенерации в области дефекта. Здесь представлена иммуногистохимия на ядерный антиген человека, демонстрирующая преобладание человеческих клеток в области дефекта через две недели.

После освоения методики обработка жировой ткани может быть выполнена в течение четырех часов, а хирургическая процедура занимает около 10 минут на одну мышь. Важно помнить, что теменная кость имеет округлую форму, в то время как сверло — плоское, поэтому необходимо принять меры, чтобы полностью сформировать дефект диаметром 4 мм по всей окружности. Помните, что сверлить нужно медленно, чтобы избежать повреждения твердой мозговой оболочки головного мозга.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как выделять клетки-предшественники из жировой ткани. Посейте эти клетки на скаффолд и пересадите их мыши.