Преодоление Био-Электронный интерфейс с Biofabrication

Общая цель следующего эксперимента заключается в электрическом осаждении биополимерных пленок и их функционализации биологическими компонентами, такими как белки и клетки. Электроосаждение достигается за счет использования изменения pH, которое происходит локально на смещенном электроде, в сочетании с раствором полисахаридов, реагирующим на pH. При выборе стратегии катартического или анодного осаждения электрод смещается, чтобы запустить переход геля души, который генерирует тонкую пленку, имеющую рисунок, определяемый электрогеометрией.

Кроме того, биологические компоненты, такие как белки и клетки, могут быть введены в процесс электродного осаждения. С целью биологической функционализации пленки получены результаты, которые показывают, что биологические компоненты локализованы в пленках на основе флуоресцентной визуализации. Кроме того, компоненты функциональны и способны взаимодействовать с окружающей средой, что подтверждается электрохимическим детектированием ферментативной активности и использованием реакции репортерных клеток.

Биопроизводство предоставляет новый набор инструментов для создания интерфейса между биологией и электроникой. Мы считаем, что его основными преимуществами являются простота и способность к сборке в условиях, близких к физиологическим. Биология является экспертом в производстве на наноуровне с помощью самосборки и ферментативных средств. Используя эти возможности, мы обходим сложные, опасные и трудоемкие методы синтеза, которые используются в других методах сборки.

Идея создания интерфейса устройства BioD с использованием биологических материалов и механизмов пришла к нашей совместной команде, когда мы увидели, что их воздушные змеи могут быть насажены электродами. Китан представляет собой полисахарид, реагирующий на pH, образующий пленку, который может распознавать электрические сигналы, навязанные устройством, и осаждаться в виде тонкой пленки. Как только мы увидели, что китан можно осаждать на электроды, мы поняли, что можем получить доступ к более широкому набору инструментов из биохимии и молекулярной биологии для создания интерфейса устройства BioD.

Применение такого метода распространяется на настройки лабонских чипов, где требуется функциональный биологический компонент, поскольку они обеспечивают дешевый и простой способ локализации таких компонентов на электроде, где они могут оставаться жизнеспособными. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как пленка для биопроизводства может быть специальной и легко повреждаться. Таким образом, нужно быть осторожным, чтобы не быть слишком резким во время мытья или съемки пленки.

Как можно было бы назвать фильм, его легко потревожить. Тем не менее, в качестве преимущества электропроводка можно использовать повторно, потому что пленка легко удаляется. Чтобы начать этот протокол, подключите источник питания к изготовленным электродам с помощью патч-кордов с помощью зажимов типа «крокодил».

Оксид индия и олова или предметное стекло, покрытое ITO, будет действовать как анод или рабочий электрод; платиновая фольга будет служить катодом или противоэлектродом расположить электрод таким образом, что поверхность ITO будет функционализирована напротив противоэлектрода таким образом, что поверхность IT O будет расположена либо вертикально для погружения в раствор, либо горизонтально. такой, чтобы раствор мог содержаться на поверхности. Затем приготовьте раствор для осаждения альгината, смешав 1% альгината и 0,5% карбоната кальция в дистиллированной воде и автоклавируя смесь. Затем флуоресцентно пометьте альгинат флюористыми сферами путем перемешивания и вортексирования.

Это позволит проводить флуоресцентную визуализацию полученной пленки После автоклавирования раствор погружают оба электрода в приготовленный раствор для осаждения с постоянной плотностью тока три ампера на квадратный метр в течение двух минут. Напряжение будет смещаться в диапазоне от двух до трех вольт Через две минуты отсоедините электрод и удалите раствор без отложений. Аккуратно промойте пленку хлоридом натрия, чтобы удалить лишний альгинат.

Кратковременно инкубируйте пленку в 0,1 моляра хлорида кальция для укрепления геля. Затем пленку инкубируют в нужном растворе для хранения. Приступайте к изображению пленки с помощью флуоресцентной микроскопии перед совместным осаждением.

Вырастите культуру клеток-отправителей сигнала и культуру клеток-приемников сигнала, как указано в письменном протоколе, прилагаемом к этому видео. Далее готовят раствор для осаждения альгината и карбоната кальция. Смешайте раствор с каждой клеточной культурой в соотношении один к одному до конечной концентрации 1% альгината и 0,5% карбоната кальция, при этом клетки разбавляют примерно до половины плотности культивирования.

Используйте предметное стекло с рисунком из двух электродов ITO, содержащихся в лунке с полидиметилсиланом и счетчиком платины. Подключите один электрод ITO и платиновый электрод к источнику питания. Как и раньше, погрузите электроды в раствор для осаждения, содержащий ячейки приемника.

Настройте источник питания на постоянный ток с плотностью три ампера на квадратный метр, где размер поверхности определяется одним электродом, на котором будет происходить осаждение. Подайте ток в течение двух минут, чтобы обеспечить совместное осаждение клеток в альгинатной матрице. Промойте пленку хлоридом натрия как и раньше, переключите антикабельное соединение на соседний электрод ITO.

Повторите процедуру осаждения, но уже на этот раз. Вводим раствор, содержащий ячейки отправителя. Инкубируйте двухэлектродный чип, содержащий осажденные клетки и аргенат кальция, в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в фосфатно-солевом буфере.

С добавлением 10% LB среды и одного миллимоляра хлорида кальция. После инкубации изображения чипа с помощью флуоресцентного микроскопа начинают осаждение хитозанового электрода. Подключите блок питания к электродам.

Зажигайте зажимы из кожи аллигатора. Кремниевый чип с золотым покрытием будет выступать в качестве катода, а платиновая фольга будет служить анодом. Расположите поверхность золотого электрода так, чтобы она располагала противоэлектрод, как и раньше.

Приготовьте раствор песка Като, смешав хлопья песка Като с водой и медленно добавив два молярных хлористых водорода для растворения полисахаридов. После процедуры, указанной в тексте, раствор песка Като может быть флуоресцентно помечен для получения изображения нанесенной пленки электрода с помощью флуоресцентной микроскопии. Электроды в раствор кайзана полностью погружают нужную область для осаждения.

В течение двух минут подайте постоянный ток, рассчитанный при плотности четыре ампера на квадратный метр исходя из площади поверхности рабочих электродов. В этом случае ток в 16 микроампер подается на золотой электрод квадратным диаметром четыре миллиметра, напряжение будет меняться в пределах двух-трех вольт после промывки электрода деионизированной водой для удаления лишнего хитозана. Приступайте к изображению пленки с помощью флуоресцентного микроскопа, копосхитозана и глюкозооксидазы из раствора с плотностью тока четыре пандуса на квадратный метр на узорчатом электроде.

В соответствии с процедурой осаждения электродов хитозана будет получена пленка кайзана, захваченная глюкозооксидазой. Присоедините обработанный электрод к трехэлектродной системе в качестве рабочего электрода, платиновую проволоку в качестве контрэлектрода и серебро, хлорид серебра в качестве электрода сравнения, погрузите электроды в фосфатный буферный раствор, содержащий хлорид натрия. Электрохимически конъюгируйте белок с пленкой казама, подавая постоянное напряжение в течение 60 секунд с помощью хронопирометрии после конъюгации.

Поместите чип в фосфатный буфер и промойте в течение 10 минут орбитальным шейкером, чтобы удалить нереактивный хлорид натрия и неконъюгированную глюкозооксидазу. Снова прикрепите систему из трех электродов и погрузите в нее раствор глюкозы с пятью миллимолярами. Затем установите желаемые параметры для циклической волочной телеметрии для развертки потенциала в положительном направлении до 0,7 вольт.

Извлеките электроды из раствора глюкозы и промойте фосфатным буфером. Затем поместите электроды между стаканом объемом 10 миллилитров, содержащим восемь миллилитров фосфатного буфера, на магнитную мешалку. GOX функционализировал микросхему до 0,6 вольт, которая служила рабочим электродом.

После установки желаемых параметров соберите базовую запись. Добавьте аликвоты глюкозы в буфер для увеличения концентрации глюкозы на четыре миллимоляра для каждой аликвоты В этом эксперименте в буфер добавляют 400 микролитров аликвот 80 миллимолярной глюкозы. Соотнесите выходной ток с концентрацией глюкозы для каждой концентрации глюкозы: Чтобы построить стандартную кривую для выполнения функционализации белка, используйте предметное стекло с узором из соседнего золота и электрода ITO, содержащегося в A-P-D-M-S.

Что ж, сместите золотой электрод с катарсическим потенциалом к электродному отложению, как показано ранее. После полоскания пленки добавьте раствор синего флуоресцентно меченного автоиндуктора двух синтаз, дополненных тирозиназой. После одночасовой инкубации при комнатной температуре.

Промойте пленку PBS, как и раньше, подайте анодный потенциал на электрод ITO, погруженный в раствор альгинатного осаждения, содержащий приемные ячейки. Продолжайте выполнять те же шаги, которые описаны в разделе Совместное осаждение клеточных популяций в альгинате для генерации передаваемого сигнала ферментативным путем. После промывки пленки добавьте раствор из пяти микромоляров, SAH и PBS с добавлением 10%-ного фильтрующего материала и одного миллимолара.

Хлоридом кальция покройте электроды, чтобы предотвратить испарение раствора, и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Это позволит получить реакцию клетки-приемника путем генерации красного флуоресцентного белка DS; красные соседние электроды могут быть визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии методом justing. Фильтры для улавливания синей флуоресценции также индуктора двух синтаз и красной флуоресценции, экспрессируемой кооптированными электрическими сигналами, могут создавать локализованные микросреды вблизи поверхности электрода, и эти стимулы могут вызывать самосборку полисахаридов, таких как альгинат и разан, для осаждения в виде гидрогелевой пленки на поверхности электрода.

Поскольку этот переход геля души происходит на поверхности электрода, полученная пленка подвергается электрообработке с геометрией, соответствующей схеме электродов. С помощью альгината уникальные клеточные популяции были содепонированы по разным адресам. Подтверждение адресов их электродов наблюдается при взаимодействии между популяцией клеток отправителя и получателя.

Молекула автоиндуктора два диффундирует из клеток-отправителей и поглощается клетками-приемниками, что приводит к экспрессии красного флуоресцентного белка DS. Здесь. Красная флуоресценция наблюдается только на электроде, куда адресованы приемники. И наоборот, биочувствительный фермент глюкозооксидаза обеспечивает способность обнаруживать глюкозу посредством ферментативной реакции путем производства перекиси водорода, которая затем может быть электрохимически окислена с образованием выходного тока.

Таким образом, химический сигнал может быть преобразован в электрический. Этот график показывает, что пленки, в которых Geo X был химически конъюгирован, производят сильный антик-сигнал в присутствии глюкозы, в отличие от пленок, не содержащих Geo X. Эти результаты указывают на то, что Geo X может быть собран на осажденной пленке zam и/или сохранять каталитическую активность. Кроме того, происходит ступенчатое увеличение глазного тока в ответ на повышение концентрации глюкозы.

Стандартная кривая также показывает, что ступенчатое увеличение происходило почти линейно в зависимости от количества добавленной глюкозы. Эти результаты показывают, что фермент также сохраняет свою чувствительность при конъюгации с пленкой Razza, как показано здесь, синтаза I 2 включает метку тирозина пента. Тирозиназа действует на тирозиновую метку, окисляя остатки фенольных групп до o хинонов, которые затем ковалентно связываются с амином Казана, что свидетельствует о функционализации пленки Kazam внутри a i 2 синтазы путем сборки тирозиназы наблюдается на этом флуоресцентном изображении, показывающем пленку kaza на золоте, где функционализированная I два синтаза была флуоресцентно помечена синим цветом, потому что a I 2 синтаза генерирует I два из подложки SAH таким же образом В качестве клеток-отправителей его близость к кооптированным клеткам-реципиентам в присутствии SAH также заставляет клетки-реципиенты флуоресцентно реагировать экспрессией ds.

Красная красная флуоресценция клеток-реципиентов снова демонстрирует взаимодействие между адресами из-за диффузии ai, двух из одного в другой, а также указывает на то, что 10 ферментов, иммобилизованных в тизен, сохраняют активность после ковалентного связывания. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как наносить полисахаридные пленки методом электроосаждения и как их функционализировать с помощью различных методов. Мы продемонстрировали универсальность этих этапов функционализации, что позволило нам работать с множеством биологических компонентов в дальнейших испытаниях.

После освоения этой техники она может быть выполнена всего за несколько минут для создания четко определенных пленочных узоров, на которые можно точно привить биологические компоненты. Таким образом, мы можем очень легко создавать биологически структурированные и активные поверхности на определенных электродах, и все это делается организованным образом, и в то же время позволяет осуществлять сложные биологические взаимодействия. Следуя этой процедуре, творческий подход может быть использован как при проектировании электроматрицы, так и при выборе биологических компонентов для достижения проектного взаимодействия.

Мы надеемся, что инструменты биопроизводства соединят две несопоставимые области: биотехнологию и микроэлектронику, каждая из которых по отдельности произвела революцию в нашей жизни. Мы верим, что, взаимодействуя с этими двумя областями, мы сможем найти новые решения некоторых из наиболее насущных проблем общества. Например, мы предполагаем, что биопроизводство может предоставить простые и универсальные методы для новых способов зондирования, для оказания медицинской помощи, диагностики заболеваний и обнаружения биологических и химических угроз.

Одним из далеко идущих примеров может быть то, что артериальный стент следующего поколения также сможет контролировать ваш метаболический профиль, а также держать артерию открытой.