Chemoselective Модификация поверхности с помощью вирусного Bioorthogonal химии нажмите

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать гибкий метод переработки поверхностей вирусов с помощью клик-химии. На первом этапе данной процедуры клетки эмбриональной почки человека инфицируют аденовирусом 5-го типа и инкубируют в присутствии либо ненатуральной аминокислоты гомоаланина, либо ацетосахара N-ацетоацетилглюкозамина. Через два дня частицы аденовируса с азидной меткой собирают и очищают.

Затем для пришивания флуоресцентных зондов к поверхности этих частиц используется химиоселективное азид-алкиновое циклоприсоединение. Как поясняется в письменном протоколе, это выполняется одним из двух возможных методов лигирования: с использованием напряжения в кольце или с помощью катализа меди.

В терапевтических целях такие прикрепленные группы могут представлять собой полипептидные полимеры или малые молекулы. В данном эксперировании используется флуоресцентный зонд, чтобы продемонстрировать лигирование зонда к белкам капсида с помощью SDS-PAGE. Существует значительный интерес к разработке вирусов в качестве агентов доставки генов, особенно в контексте терапии, доставки генов, онкологической терапии и технологий создания вакцин.

В данном контексте настройка интерфейса «вирус — хозяин» особенно важна для придания терапевтическому препарату свойств, необходимых для таргетного воздействия на ткани с целью стимуляции иммунного ответа. Существует ряд других факторов, имеющих значение при настройке интерфейса «вирус — хозяин». В связи с этим нами был разработан двухэтапный протокол маркировки.

Первым этапом является метаболическое введение ненатуральной аминокислоты или ненатурального сахара. Это создает точку прикрепления, которую затем можно модифицировать с помощью высокоселективных методов химического синтеза, что позволяет придать вирусам практически любую необходимую функциональность без существенного влияния на их инфекционность или общую жизнеспособность, что является основным препятствием, которое необходимо преодолеть. После стерилизации вытяжного шкафа и лабораторного оборудования подготовьте 11 культуральных чашек диаметром 100 мм с клетками HEK 293, поддерживаемыми в среде для роста HEK при 37 °C.

После того как клетки в культуре достигнут 80–90% конфлюэнтности, удалите ростовую среду из одной из чашек и один раз промойте ее буфером TD. Отделите клетки, добавив один миллилитр трипсина-ЭДТА, и инкубируйте в течение одной минуты. Добавьте девять миллилитров ростовой среды и подсчитайте количество собранных клеток в этой чашке.

С помощью гемоцитометра рассчитайте количество частиц аденовируса, необходимых для заражения каждой из 10 оставшихся культуральных чашек. Медленно удалите питательную среду, затем промойте пятью миллилитрами буфера TD. Добавьте один миллилитр буфера для заражения и инкубируйте в течение одного часа.

После инфицирования осторожно встряхивайте чашки из стороны в сторону каждые 15 минут. Осторожно добавьте по 9 мл среды для роста HEK в каждую чашку и инкубируйте еще 18 часов. Из концентрированных стоковых растворов HA в цистине.

Приготовьте среду для мечения HA в соответствии с письменным протоколом. Перед этим обязательно профильтруйте эти исходные растворы через шприцевой фильтр с размером пор 0,2 мкм. Стерилизуйте исходный раствор метионина для контроля аналогичным способом, затем осторожно удалите питательную среду и промойте каждую культуральную чашку пятью миллилитрами буфера TD.

Замените эту среду на 10 milliliters среды для мечения HA и инкубируйте инфицированные клетки еще в течение шести часов. Теперь белки вирусного капсида будут транслироваться в присутствии азо-гомоаланина и в отсутствие метионина. Осторожно замените среду для мечения на 10 milliliters свежей ростовой среды и инкубируйте еще 18 часов.

После завершения этого этапа перейдите к процедуре очистки, описанной в третьем шаге видео. В качестве альтернативы azi-метки могут быть введены с помощью сахаров, содержащих azi, вместо ненатуральной аминокислоты a HA. В данном протоколе используется n-ацетоацетил-галакто-α-метаболический предшественник UDPN-ацетоацетил-глюкозамина; паразиты выращиваются в присутствии этого ацетосахара.

Аденовирус 5-го типа будет иметь азидные группы только на фибрилле для проведения маркировки сахарами. Сначала выполните первый шаг видео до появления подсказки на экране. Это соответствует шагу 1.5 в письменном протоколе.

Приготовьте раствор для маркировки сахарами, сначала дозировав 100 microliters стокового раствора сахара ATO в пробирки Falcon и дав метанолу испариться. Затем добавьте 100 milliliters ростовой среды HEK. Покройте клетки в каждой чашке 10 milliliters этой среды для маркировки сахарами и инкубируйте при 37 degrees Celsius в течение 44 часов.

Перейдите к третьему этапу для проведения очистки. Перенесите среду вместе с инфицированными клетками из культурального чашки в два конических тюбика и центрифугируйте при 2000 G в течение 10 минут при температуре 4 °C.

Удалите супернатант и ресуспендируйте каждый осадок в четырех миллилитрах буфера TD, используя жидкий азот и водяную баню при 37 °C. Выполните три цикла замораживания-оттаивания для лизиса инфицированных клеток. Перемешивайте суспензию с помощью вортекса между каждым циклом.

Центрифугируйте суспензию после размораживания при 2000 G в течение 10 минут для осаждения клеточного дебриса; поскольку аденовирус, использованный для инфицирования на первом этапе, содержал трансген GFP, флуоресцентная активность на данном этапе подтверждает трансдукцию и экспрессию вирусной ДНК. Тщательно приготовьте градиент плотности хлорида цезия от 1,25 г/мл до 1,4 г/мл. Перенесите супернатант лизата клеток на градиент плотности и центрифугируйте при 126 000 G в течение одного часа при 15 °C.

После центрифугирования в центрифужной пробирке должна образоваться плотная широкая полоса. Это модифицированный azi-вирус. Используя иглу star L, проколите дно пробирки так, чтобы содержимое стекало по каплям, и осторожно соберите этот вирус.

Полоса двух методов лигирования продемонстрировала влияние напряжения. Напряженно-стимулируемый путь предполагает более простые условия реакции, однако его недостатком является более ограниченный выбор коммерчески доступных зондов для проведения напряженно-стимулируемого лигирования. Смешайте 50 µL ази-модифицированного вируса в буфере для хранения вируса с 0,25 µL маркирующего раствора Tamara BCN, перемешивая путем постукивания по дну пробирки, закрытой фольгой, и инкубируйте в режиме ротации в течение ночи при комнатной температуре.

Очистите клик-вирус с помощью центрифужной гель-фильтрации. Проведите уравновешивание спиновых колонок буфером для хранения вируса. Деоксигенизированная медная катализируемая циклоприсоединение обеспечивает большую доступность зондов, но имеет недостаток в виде необходимости использования специализированного оборудования для поддержания бескислородной атмосферы.

Для проведения лигирования, катализируемого медью, сначала дезоксигенируйте все реакционные материалы и растворы в перчаточном боксе с азотом в течение шести часов. По истечении этого времени приготовьте в перчаточном боксе стоковый раствор катализатора на основе меди(I) для инициирования реакции. Добавьте 1 µL этого стокового раствора меди к 50 µL раствора вирусного зонда и хелатирующего агента.

Оставьте реакцию мечения протекать в перчаточном пакете в течение ночи. Очистите полученный фильтрат, как описано в шаге четыре. После кипячения очистите «кликнутый» вирус и буфер для лизиса образцов в течение 10 минут.

Заполните лунки выбранным вирусом и контрольными образцами, затем проведите электрофорез. Держите камеру накрытой фольгой, чтобы защитить флуоресцентный зонд от света. Через один час просканируйте гель с помощью флуоресцентного сканера гелей.

Обратите внимание, что интактные или немеченые I вирусы не должны вытеснять значительное количество флуоресцентных меток при маркировке HA; вирусы, полученные при более высокой концентрации HA, демонстрируют более интенсивную флуоресцентную метку из-за более высокой степени включения HA. Также следует отметить, что вирус, меченый сахаром, экспрессирует azi-метки только в капсидном белке волокна. Начиная с достижения 80% конфлюэнтности клеток, заложите два дня на инфицирование при azi-маркировке, пять часов на сбор и очистку меченого вируса, одну ночь на клик-реакцию и два часа на анализ методом SDS-PAGE, что в общей сложности составляет три с половиной дня. Таким образом, были продемонстрированы два метода azi-маркировки и две реакции клик-химии с использованием азидоалкинов.

Выбор подходящего метода или методов должен основываться на целях вашего исследования и имеющихся ресурсах. Хотя все материалы, описанные в данном протоколе, доступны в коммерческой продаже, мы установили, что синтез ацетосахаров HA и зондов INE значительно более экономичен и обеспечивает большую гибкость при модификации поверхности вируса.