Высокая пропускная способность последовательного ELISA для проверки биомаркеров острого трансплантат против хозяина

Общая цель данного эксперимента заключается в использовании высокопроизводительной последовательной Элизы для эффективного анализа большого количества новых биомаркеров, которые были обнаружены с помощью протеомики. Это достигается путем добавления образцов на исходную пластину, которая используется для создания разведения для каждого биомаркера и для хранения восстановленной плазмы между тестами. Затем тест Элизы запускается для каждого белка, чтобы определить его концентрацию в образцах пациентов.

В конечном счете, можно оценить повышение уровня белка этих биомаркеров в начале клинических проявлений острого заболевания «трансплантат против хозяина». Основное преимущество этого метода перед существующими методами заключается в том, что последовательные анализаторы могут анализировать несколько новых белков, которые не всегда доступны с платформами через мультиплексирование. Применение этого метода распространяется на диагностику острой реакции «трансплантат против хозяина».

Поскольку биомаркеры, проверенные с помощью этого метода, в настоящее время исследуются для клинической помощи. Тем не менее, этот метод может дать представление об осложнениях при посттравматической трансплантации поэтических стволовых клеток. Он также может быть применен для обнаружения и проверки биомаркеров для других заболеваний, таких как трансплантация легких, осложнения, рак легких или потенциально любое заболевание, для которого будет полезен диагностический анализ крови.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как важно, чтобы несколько этапов выполнялись последовательно для обеспечения воспроизводимости и низкой вариабельности партий За день до эксперимента открутите мысленные образцы аликвот в течение 10 минут при 15, 300 RCF и четырех градусах Цельсия, чтобы отделить сгустки внизу и липиды вверху от плазмы. Затем 150 микролитров неразбавленной плазмы из каждого образца помещают на 96-луночный V-образный нижний планшет путем ручного пипетирования в соответствии с заранее заданными картами. Оберните тарелку в Paraform и поместите ее в человеческую камеру при температуре четыре градуса Цельсия на срок до 72 часов.

Затем, после восстановления и разбавления IL двух рецепторов альфа и фактора роста человека, или антител HGF захватывающих в соответствии со спецификациями производителя, пластину ввозят 50 микролитров аликвот каждого антитела в каждую лунку из соответствующих 96 лунок с высокой связываемостью. Затем запечатайте эти пластины с помощью запайщика для планшетов и инкубируйте их в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Теперь разведите reg three alpha с буфером покрытия производителя согласно протоколу производителя и нанесите 25 микролитров раствора в каждую лунку 3 лунки 84 no maxor plate.

Затем храните эту пластину запечатанной при температуре четыре градуса Цельсия и в первый день эксперимента. Начните с промывки тестовой пластины с двумя альфа-рецепторами IL и блокируйте ее блотто в TBS. После восстановления стандарта установите стандартную кривую из восьми пунктов в соответствии с протоколом производителя.

Следующая пластина, 50 микролитров неразбавленной плазмы и по 50 микролитров каждого стандарта в двух экземплярах с исходной пластины на тестовую пластину ELIZA. Затем инкубируйте герметичную пластину при комнатной температуре на пластине-ротаторе, установленном на 300 об/мин. Через два часа заберите плазму из тестовой пластины IL two receptor alpha ELIZA и поместите ее обратно в неразбавленную плазменную исходную пластину.

Затем, после завершения ОВОС в соответствии с протоколом производителя, считайте оптическую плотность каждой лунки с помощью планшетного ридера, установленного на 450-570 нанометров для богатой тройки альфа-Элиза, сначала переведите 10 микролитров неразбавленной плазмы на отдельную нижнюю исходную пластину, а затем добавьте 90 микролитров предоставленного производителем буфера разбавления в каждую лунку, чтобы создать исходную пластину разбавления от одного до 10. После завершения Reg three alpha Eliza, в соответствии с протоколом производителя, добавьте стоп-раствор в планшет на 384 лунки и считайте оптическую плотность каждой лунки с помощью считывателя пластин, установленного на 450-620 нанометров. После восстановления и разбавления слона и tn FFR антител одного захвата в соответствии со спецификациями производителя кодируют каждую лунку из соответствующих 96-луночных полулунок с высокой связываемостью 50 микролитрами антител захвата.

Затем инкубируйте герметичные тестовые планшеты в течение ночи при комнатной температуре для слоновьей пластины и при четырех градусах Цельсия для TN FFR одной пластины. После завершения ИЛ два рецептора альфа Элизы переносят 60 микролитров неразбавленной плазмы на новую исходную пластину. Затем по 60 мкл 1%-ной БСА в PBS на каждую лунку делают одну-две разбавленные плазменные исходные пластины.

Затем промойте и заблокируйте тестовую пластину HGF с помощью BLOTTO в TBS, а затем настройте стандартное разведение по восьмиточечной кривой. После промывки планшета, следуя этапу блокировки планшета 50 мкл, продублируйте аликвоты одной-двух разбавленных плазм и каждого стандарта на тестовой пластине EISA. Затем инкубируйте герметичную пластину в течение ночи при комнатной температуре на пластине-ротаторе, установленном на 300 об/мин.

На следующее утро изберите одну-две разбавленные плазмы из тестовой пластины HGF Eliza и поместите ее обратно в одну или две разбавленные плазменные пластины. После завершения ОВОС, согласно протоколу производителя, считайте оптическую плотность каждой лунки с помощью планшетного ридера, установленного на 450-570 нанометров на второй день эксперимента. Сначала перенесите 10 микролитров неразбавленной плазмы на новую исходную пластину, а затем 190 микролитров 1% БСА в PBS, чтобы получить 200 микролитров от одного до 20 разбавленной плазмы.

Затем, после завершения работы со слоном, Элиза, в соответствии с протоколом производителя, считывала оптическую плотность с помощью считывателя пластин, установленного на 450-570 нанометров. Для TN FFR Элиза сначала добавляет 25 микролитров 1% BSA и PBS в исходную пластину от одного до 20, в результате чего получается 125 микролитров разбавленной плазмы от одного до 25 на лунку. Затем, после завершения TN FFR одного ИФА в соответствии с протоколом производителя, считайте оптическую плотность каждой лунки с помощью планшетного ридера, установленного на 450-570 нанометров для первого переноса I-L-H-E-I-A, 60 микролитров одной-двух разбавленных плазм на новую исходную пластину, а затем добавьте 180 микролитров восьми разбавителей IL в каждую лунку, чтобы получить исходную пластину от одного до шести разбавленных плазм.

Затем, после завершения ILH Eliza в соответствии с протоколом производителя, считайте оптическую плотность каждой лунки с помощью планшетного ридера, установленного на 450-570 нанометров. Наконец, как только все Элизы будут готовы, замените неиспользованную разговорную плазму в мысленную Элокву и заморозьте для будущего использования. На этом графике показана оптическая плотность для стандартной кривой семи различных планшетов ELIZA, измеряющая концентрацию альфа в трех точках, соответствующую 1084 пациентам, протестированным для первоначального отчета о биомаркере заболевания желудочно-кишечного тракта в зависимости от биомаркера заболевания хозяина в соответствии с регистрацией альфа-трансплантата

Концентрации белков в образцах плазмы были рассчитаны путем сравнения оптических плотностей образца со стандартными оптическими плотностями кривой. Роботизированная платформа для обработки может быть использована для дальнейшего повышения воспроизводимости при одновременном уменьшении объема используемой плазмы при работе с Eliza и формовочными пластинами. Планируя эту процедуру, важно сначала запустить EIS, то есть неразбавленную плазму, чтобы ее можно было восстановить и использовать в последующих экспериментах после ее разработки.

Этот метод проложил путь для исследователей в области протеомики к изучению потенциальных биомаркеров при любом заболевании, представляющем интерес, путем повсеместного использования последовательных препаратов Eliza. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проверить несколько биомаркеров с помощью последовательного Е, используя при этом небольшие объемы плазмы и минимизируя свободные циклы.