Использование LysoTracker обнаружить запрограммированной смерти клеток в эмбрионы и дифференциации эмбриональных стволовых клеток

Цель данной процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать, как поддерживать лизосомы двух типов образцов, эмбрионов мышей и дифференцированных стволовых клеток с помощью лио-трекера, для обнаружения закономерностей клеточной гибели. Чтобы подготовить образцы эмбрионов, эмбрионы сначала хирургически изолируют и помещают в чашку для получения дифференцированных клеток. Эмбриональные стволовые клетки используются для создания тел эмбрионов.

Эти тела эмбрионов культивируются в суспензии, а затем выращиваются в виде монослоя на предметном стекле камеры. Эмбрионы, все продаваемые монослойные, могут быть инкубированы в красном цвете, а затем промыты и зафиксированы образцы, затем могут быть сфотографированы для изучения и количественной оценки полученных результатов окрашивания, которые показывают Liso Tracker. Окрашивание — это простая процедура, которая может быть использована для анализа программы гибели клеток в эмбрионах и культивируемых клетках.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как туннельный анализ, заключается в том, что, поскольку краситель OT-трекера является небольшой молекулой, толстую ткань можно быстро и легко изучить. Хотя этот метод может дать представление о закономерностях запрограммированной клеточной смерти в эмбрионах мышей и дифференцированных культурах, он также может быть применен к другим типам тканей, таким как куриные эмбрионы и дифференцировочные взрослые стволовые клетки. Соедините молодых самок мышей с самцом-производителем и на следующее утро проверьте наличие вагинальной пробки, которая указывает на то, что спаривание произошло.

Полдень в день появления вагинальной пробки эффективно составляет 0,5 дня. После котуса в интересующий эмбриональный день усыпьте самку в соответствии с утвержденными протоколами и удалите матку до 10-сантиметровой чашки Петри с помощью BSS Хэнка и смойте всю кровь. Отделите эмбрионы и удалите их из матки.

Удалите лишние эмбриональные оболочки и сделайте по крайней мере одно полоскание BSS Хэнка, чтобы удалить посторонние ткани и кровь. Во время уборки храните препарированные эмбрионы на льду. Остальные.

Приготовьте пять миллилитров раствора для окрашивания эмбрионов Liso tracker. Это достаточный объем для одной-двух коллекций эмбрионов. Аккуратно перемешайте раствор, чтобы равномерно рассеять краситель, затем перенесите эмбрионы в раствор и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45 минут.

После инкубации аккуратно промойте эмбрионы в BSS Hank's четыре раза по пять минут при каждой стирке. Важно делать полоскания аккуратно, чтобы не повредить ткани. Удалите жидкость, медленно обращая пристальное внимание на то, где находятся нежные эмбрионы, и всегда оставляйте часть жидкости под их покрытием.

Затем закрепите эмбрионы в 4%-ном параформальдегиде на ночь следующего дня. Промойте эмбрионы один раз в BSS Хэнка в течение 10 минут, чтобы удалить фиксатор. Теперь обезвожьте ткани с помощью метанолового ряда, чтобы устранить фоновое окрашивание.

На этом этапе улучшается соотношение сигнал/шум во время визуализации перед хранением. При необходимости соберите образец ткани у каждого эмбриона для генетического анализа. Позже регидратируйте образец ткани перед генотипированием.

Разделите эмбрионы на отдельные пробирки с этикетками, соответствующими образцу ткани. Теперь есть возможность хранить выделенные эмбрионы неограниченное время в метаноле при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Защищен от света.

Начните с подготовки тел эмбрионов методом подвешенных капель. При начальной плотности 500 клеток на 20 мкл капли через трое суток перенесите тела эмбрионов в суспензионные культуры на 10-сантиметровые неадгезивные чашки Петри. Культивируйте их в течение пяти дней, меняя носители каждые два дня после пяти дней.

Перенесите тела эмбрионов в желатинизированные восьмикамерные предметные стекла, поместив в каждую камеру одно или два тела эмбриона. Культивируйте тела эмбриона еще 10 дней. Меняя среду через день через 10 дней, аккуратно отсасывайте имеющиеся среды и добавьте в каждую камеру по 300 микролитров раствора для окрашивания клеток Lyo tracker

Будьте осторожны при ручном выводе фильтрующего материала, поместив наконечник пипетки в угол камеры. Таким образом, вы случайно не снимете, еще крепя каждый корпус со стеклянной поверхности. При повторном добавлении обратного носителя поместите наконечник дозатора в угол камеры и очень медленно добавляйте его обратно.

Инкубируйте камеры при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Затем дважды промойте их с помощью DPBS в течение пяти минут за одно полоскание. Теперь зафиксируйте клетки в 4%-ном паральдегиде на 15 минут при комнатной температуре.

Затем снимите фиксатор с DPBS в два пятиминутных полоскания. Чтобы установить эмбрионы, поместите их в глубокую углубительную стеклянную горку или небольшую чашку Петри для инфекционного щитка. Подготовьте образцы клеток к микроскопии путем аспирации DPBS.

Снимите камеру с предметного стекла и дайте ей высохнуть на воздухе в течение примерно пяти минут. Накройте пленкой для защиты флуро. Затем добавьте водный монтажный материал, такой как векторный щит с помощью dappy, и поместите сверху защитное стекло

Теперь слайд смонтирован и готов к визуализации. Визуализируйте образцы с помощью препарирующего или составного микроскопа, оснащенного стержнем, домином или техасским красным фильтром. Пятна обычно довольно яркие, поэтому в ручном режиме длительные выдержки обычно не нужны.

Сделайте цифровые фотографии всех образцов при одинаковых условиях экспозиции. Чтобы количественно оценить изображения, откройте их в Adobe Photoshop или аналогичной программе для работы с изображениями. Чтобы определить степень окрашивания lyo трекера, выберите красный канал.

Обратите внимание на количество пикселей для всего изображения, отображаемое функцией гистограммы. Следующий порог, изображение таково, что красное окрашивание теперь представлено белыми пикселями. Это преобразует изображение в черно-белое.

Выберите пороговый уровень и используйте его для всех изображений в наборе. Выделите белые пиксели с помощью инструмента цветового диапазона и используйте функцию гистограммы для получения общего количества белых пикселей. Используйте синий канал для подсчета количества ядер в поле.

Может быть полезно вести учет подсчета путем аннотирования изображения, записывать значения и использовать их для вычисления среднего уровня окрашивания на ячейку. Повторите этот анализ с тем же пороговым значением для всех остальных изображений. Для отбора проб был использован трекер для окрашивания мутантных эмбрионов звукового ежа.

Поскольку ly O трекер представляет собой маленькую, сильно диффузионную молекулу, участки глубоко внутри тела целого эмбриона, окрашенные на 10,5 дней после cotus, запрограммированная гибель клеток или PCG была значительно увеличена у эмбрионов с нулевым мутантом у звукового ежа, особенно в конечностях и, возможно, в других областях. Бутоны конечностей были визуализированы в отверстиях с большим увеличением для оценки общей картины. Рассеченные участки также были разрезаны вибрирующим микротоном.

Стрелка указывает на повышенное окрашивание в нулевом дистальном конце звукового ежа на срезах, полученных с помощью криостатного туннельного окрашивания, использовавшегося в сочетании с OT Tracker в этих срезах, хотя нет строгой взаимно-однозначной корреляции между lyo tracker и туннельным окрашиванием, общие области PCD значительно перекрываются при большем увеличении. Можно увидеть прокол с положительным пятном с помощью туннельного анализа, но не прокол с отра матрицей, который окрашивается только с помощью матрицы лиры и прокола с перекрывающимся окрашиванием. После 10 дней культивирования эмбриона клетки дифференцировались в различные типы клеток, включая нейроны, мышечные клетки и кардиомиоциты.

В нормальной культуре дифференцированных ЭС-клеток есть несколько клеток, которые подверглись ПЦД, что было обнаружено с помощью лиотрекера и туннельного анализа. Затем клетки обрабатывали перекисью водорода, чтобы вызвать окислительную стрессовую гибель клеток. Низкая доза перекиси водорода увеличивала как лио-трекерное, так и туннельное окрашивание по сравнению с отсутствием лечения.

Аналогично результатам, полученным в эмбрионе, оба окрашивания помечены как общие и уникальные клетки. Высокая доза перекиси водорода приводила к усадке клеток и более широкому распространению OT-трекера и туннельного положительного результата. Для сравнения, сывороточное голодание использовалось для индукции аутофагии после одного часа сывороточного голодания.

Увеличено окрашивание трекера ОТ. Тем не менее, туннельный позитив остался на нормальном уровне. Таким образом, несмотря на то, что REER является простым и полезным, важно провести дополнительные анализы, чтобы определить, представляет ли окрашивание апоптоз или аутофагию после количественной оценки образцов.

Используя простой метод Photoshop, продемонстрированный ранее, результаты подтвердили, что увеличение концентрации перекиси водорода приводит к более высокому уровню окрашивания lys tracker После освоения эта процедура окрашивания может быть выполнена менее чем за два часа, если она выполнена правильно. Другие методы, такие как иммуноокрашивание NX в пять или lc три, могут быть выполнены для подтверждения типа гибели клеток. Не забывайте, что в настоящее время Trecker green работает только на живых клетках, поэтому Reca red — ваш лучший вариант для образцов, требующих фиксации.