Рецидивирующей герпетической Стромальные Кератит у мышей, модель для изучения человека HSK

Общая цель данной процедуры заключается в изучении рецидивирующей инфекции вируса простого герпеса или HSV. Это достигается путем первоначального заражения мышей таким образом, чтобы у них развилась латентная инфекция без повреждения роговицы. После полного установления латентности следующим шагом является реактивация вируса путем воздействия ультрафиолетового излучения спектра UVB; на заключительном этапе собирается слезная пленка для обнаружения выделения вируса, после чего за мышью наблюдают в течение как минимум пяти недель для мониторинга течения заболевания.

В конечном итоге степень развития заболевания у мышей может быть оценена с помощью системы оценки тяжести герпетического стромального кератита. Это заболевание поражает множество людей по всему миру. Данная патология является одной из основных причин инфекционной слепоты.

Мы используем модель на мышах для имитации данного конкретного заболевания. Существуют и другие модели, способные имитировать эту патологию, однако мы считаем, что данная модель является наилучшим представлением этого конкретного заболевания. Я хотел бы уделить несколько минут тому, чтобы представить людей, которых вы увидите в этом видео.

Это Хлоя, которая работает со мной последние несколько месяцев. Это Ниппо, студент, стажирующийся в лаборатории летом. Начните эксперимент с культивирования HSV 1 на клетках Vero в течение трех-четырех дней до достижения 80% конфлюэнтности в T 150 флаконе.

К этому времени клетки округлятся и будут легко отделяться при легком постукивании по колбе. Перенесите клеточную суспензию в стерильные конические пробирки объемом 50 миллилитров, после чего центрифугируйте клетки в течение 15 минут. Используйте настольную центрифугу при 1 510 ×g и температуре четыре градуса Цельсия.

Затем перенесите супернатант в стерильные пробирки Oak Ridge объемом 50 мл, после чего распределите в каждую коническую пробирку по 5 мл среды для ресуспендирования. Ресуспендируйте крупные осадки, затем подвергните ресуспендированные осадки воздействию ультразвука в течение одной минуты импульсами по две 32-х доли секунды. После центрифугирования супернатанта в высокоскоростном настольном центрифуге образуется небольшой вирусный осадок.

После удаления супернатанта объедините осадки с небольшими вирусными пеллетами и повторно проведите соникацию в течение 45 секунд. Затем снова центрифугируйте полученный раствор соникатированных клеток и вируса в настольной центрифуге в течение пяти минут при 280 ×g и 4 °C, после чего разлейте супернатант по аликвотам для хранения в качестве вирусного стока при -70 °C или для титрования на планшете.

Десятикратные разведения вируса из супернатанта стокового раствора вируса от 10⁰ до 10⁻⁸, дважды из двух отдельных серий разведений клеток Vero в стерильных 12-луночных планшетах; процедуру заражения начинают с анестезии мыши. Мышь должна оставаться под полной анестезией в течение 20–30 минут, чтобы вирус успел абсорбироваться до пробуждения животного.

Затем под бинокулярным микроскопом с помощью иглы 30G сделайте царапину на роговице правого глаза. После этого пронумеруйте животное с помощью пробойника по уху. Затем введите мыши 1 mL объединенной сыворотки крови человека, чтобы защитить роговицы от повреждения во время первичного заражения.

Затем с помощью дозатора на 20 µL инфицируйте поврежденный глаз дозой 10⁶ бляшкообразующих единиц, а в другой глаз введите 5 µL HBSS для поддержания увлажненности в то время, пока животное находится под воздействием анестезии для подтверждения инфекции. Увлажните стерильный ватный тампон 1 мл среды для клеток Vero. Через три дня после инфицирования протрите инфицированный глаз тампоном, а затем перенесите 100 µL полученного экссудата на клетки Vero, выращенные в 48-луночных планшетах, не ранее чем через пять недель после первичного заражения.

Проведите мазок с инфицированного глаза мыши, находящейся под воздействием анестетика, как показано на видео. Отметьте дату проведения мазка как «день 0» на крышке планшета на 48 лунок для контроля спонтанного заживления. Затем поместите мышь в транслюминатор, способный излучать UVB-свет с пиковой длиной волны 302 нанометров, таким образом, чтобы воздействию UVB-излучения подвергался только один глаз, и облучите мышь дозой 250 миллиджоулей UVB-света на квадратный сантиметр.

Затем ежедневно проводите мазок из глаза с первого по седьмой день. После УФ-B облучения для мазков, содержащих инфекционный вирус, определите количество вируса с помощью стандартного метода бляшек с использованием 12-луночных планшетов, чтобы оценить наличие клинических признаков заболевания глаз у мышей. Поместите мышь под бинокулярный dissecting-микроскоп.

Степень помутнения роговицы оценивается по шкале от нуля до четырех, где ноль соответствует прозрачной строме, а единица — легкому помутнению стромы. Двойка означает умеренное помутнение с различимой радужкой. Тройка характеризуется плотным помутнением с потерей четких деталей радужки, за исключением краев зрачка, а четверка означает полное помутнение с отсутствием обзора задних структур.

Неоваскуляризацию оценивают по шкале от одного до восьми, разделив роговицу на четыре равных квадранта и определив степень васкуляризации в каждом из них. На этом первом рисунке у латентно инфицированных мышей вызывали реактивацию с помощью УФ-В облучения, после чего в течение 35 дней наблюдали за помутнением роговицы. Эти данные показывают, что у самцов мышей C 57 black six наблюдается значительно меньшая степень помутнения роговицы, чем у самок мышей C 57 black six, так как в период с 14 по 35 день у самок мышей C 57 black six развивалось значительно более выраженное вирусное заболевание.

Аналогичным образом, при оценке неоваскуляризации роговицы в тех же экспериментальных условиях у самцов мышей наблюдался значительно меньший рост новых сосудов в роговице, чем у самок; и вновь отмечалось значительно более выраженное вирус-индуцированное заболевание у самок мышей C 57 black six в период с 14-го по 28-й день. При выполнении данной процедуры помните о необходимости полной анестезии мышей, чтобы они находились в состоянии сна от 20 до 30 минут. Надеюсь, что после просмотра этого видео вы поняли, как использовать мышиную модель рецидивирующего стромального кератита для изучения этого заболевания у людей.