Экспертиза BCL-2 Семья функции с большим однослойные везикулы

Эта биохимически определенная модельная система крупных однослойных везикул имитирует внешнюю мембрану митохондрий для изучения функций белков BCL2 in vitro. Сначала смешайте липиды и создайте липидную пленку в герметичном флаконе. Затем приготовьте свежий раствор LUV и солюбилизируйте липидную пленку.

Затем выдавите липидный раствор и очистите крупные LUV методом гель-фильтрации. Заключительным этапом является анализ LUV на предмет увеличения флуоресценции, индуцированного детергентом. В конечном итоге модельная система LUV используется для оценки функции и регуляции мембранно-проницаемых белков, таких как рекомбинантные белки BCL2.

Данный подход с использованием крупных однослойных везикул имеет несколько преимуществ по сравнению с существующими системами, такими как митохондрии. Поскольку везикулы создаются из очищенных липидов в отсутствие белков, они биохимически определены как по составу, так и по размеру.

Это позволяет четко интерпретировать результаты, так как единственными белками в исследовании являются те, которые вы добавляете. Данный метод может дать представление о механизмах способности семейства BCL2 регулировать целостность внешней мембраны митохондрий. Он также может быть применен к другим системам при изучении ремоделирования мембран и проницаемости.

Сюда относятся механизмы митохондриальной динамики или бактериальные токсины. Работайте в вытяжном шкафу при минимальном освещении. Промойте стеклянный шприц типа Hamilton Gast хлороформом.

Затем в стеклянный флакон объемом 1,5 мл добавьте 4 mg растворенных в хлороформе липидов. Для удаления хлороформа обдуйте содержимое слабым потоком инертного газа, например азота или аргона. Через два-три часа убедитесь в наличии сухой липидной пленки на дне и стенках флакона в буфере для LUV.

Приготовьте растворы полианионного красителя и ионного гасителя CAS объемом 500 µL, перемешав их на вортексе. Затем объедините растворы A NTS и DPX, перемешав на вортексе в течение одной минуты и обработав в ультразвуковой водяной бане, чтобы обеспечить полное растворение и гомогенность растворов.

Теперь добавьте раствор A-N-T-S-D-P-X к липидной пленке и запечатайте флакон парафильмом; подвергните липидную пленку воздействию ультразвука в течение пяти минут. После соникации раствор станет мутным. Убедитесь, что раствор полностью растворился, так как небольшие липидные агрегаты отрицательно повлияют на последующие этапы. Также проверьте дно и стенки флакона, чтобы убедиться в отсутствии остатков липидной пленки.

Соберите экструдер в соответствии с инструкциями производителя, используя буфер LUV для увлажнения опор фильтра и поликарбонатной мембраны; затяните корпус устройства так, чтобы избежать потери объема во время экструзии, но не слишком сильно, чтобы не повредить мембрану. Протестируйте экструдер с буфером LUV, чтобы убедиться в отсутствии утечек или проблем. Теперь наполните правый шприц липидным раствором и проведите экструзию 31 раз, чтобы крупные везикулы ELLA прошли через мембрану как минимум один раз и собрались в левом шприце. Первые несколько этапов экструзии могут потребовать чуть большего давления, если раствор внезапно и быстро проходит через мембрану.

Проверьте мембрану на наличие разрывов и при необходимости замените ее. Добавьте образец в колонку за один прием. Избегайте нарушения интерфейса сорбента.

Дождитесь полного вымывания буфера из колонки. Когда поток прекратится, перекройте колонку и осторожно заполните её буфером LUV, стараясь не потревожить гранулы. Затем откройте колонку и соберите шесть фракций по 1 мл.

AUV обычно элюируют в третьей и четвертой фракциях, что можно определить по помутнению; после этого промывочный раствор колонки собирают и хранят при температуре 4 °C. UUV в фракции колонки обнаруживают по усилению флуоресценции, обусловленному присутствием чапсов. Помните, что для всех исследований LUV следует использовать черные непрозрачные 96-луночные планшеты.

Внесите по 100 µL буфера LUV или LUV с добавлением 0,5% chaps в шесть лунок. В каждую лунку добавьте по 5 µL соответствующей фракции и перемешайте для анализа синергии biotech H one. Откройте программное обеспечение gen five 2.0, установите длину волны возбуждения 355 nm и длину волны эмиссии 520 nm.

Установите усиление напряжения в положении оптики 125 в верхней части и высоту считывания 5,5 millimeters. Теперь считайте планшет при 37 degrees Celsius и определите фракции, содержащие LUV. Соберите фракции очищенных LUV.

Данные анализы предназначены для измерения способности белков BCL2 напрямую индуцировать проницаемость LUV, а также для изучения регуляции этой активности. Смешайте компоненты анализа в указанном порядке добавления. Подробная информация о титровании белков BS и bid представлена в сопроводительной рукописи.

Инкубируйте реакционные смеси при 37 °C в течение установленных временных точек анализа. Поместите планшет в микропланшетный ридер, который встряхнет планшет и измерит флуоресценцию, как было показано ранее. В данном эксперименте используются везикулы, активированные детергентом OG, для создания положительного контроля проницаемости LUV.

Стоит отметить, что концентрации OG ниже 0,025% в данном случае не оказывают прямого влияния на проницаемость LUV. Обработка 0,5% chaps также используется для определения максимального уровня флуоресценции LUV для одного анализа. Необходимым начальным этапом изучения проницаемости LUV с помощью белков семейства BCL-2 является установление концентраций Bak и Bid, способствующих оптимальному высвобождению.

Эти кривые титрования для backs и bid демонстрируют минимальный фоновый выход и оптимальную синергию. В качестве альтернативы можно измерить проницаемость LUV кинетически. Показания снимались каждые две минуты в течение 30 минут, при этом перед каждым измерением планшет подвергался легкому встряхиванию в течение двух секунд.

В данном эксперименте определяется влияние антиапоптотического белка на проницаемость LUV, зависящую от Bak и Bid. BCL-XL ингибирует активность Bak и Bid дозозависимым образом. В анализе подавления утечки ионов этот ингибирующий эффект может быть обращен путем последующего добавления белков семейства BH3-only.

Например, белок PUMA бета связывается с BCL-xL, что позволяет BAK и BID действовать синергически и вызывать пермеабилизацию. Освоение данной методики создания крупных везикул позволяет проводить эффективный и быстрый анализ белков семейства BCL-2, пептидов и малых молекул в биохимически определенной среде, имитирующей внешнюю мембрану митохондрий. Важно, что данный анализ позволяет быстро исследовать сотни условий, используя как конечные точки, так и кинетические параметры.

Не забывайте, что оба белка, UUVs и BCL two, крайне чувствительны к артефактам, вызываемым детергентами. Используйте чистое оборудование, не содержащее детергентов, чтобы обеспечить воспроизводимость результатов.