Оценка митохондриальной функции и жизнеспособности клеток в клетках почек гиперэкспрессией протеинкиназы С Изоферменты

В данном эксперименте используется селективная модуляция изоформ протеинкиназы С для определения их митохондриальных и клеточных функций в клетках проксимальных канальцев почек при различных физиологических и патологических условиях. Сначала выделите первичные клетки проксимальных канальцев почек из коркового вещества почек или RPC, обладающие окислительным метаболизмом, сходным с метаболизмом проксимальных канальцев почек.

In vivo проведите заражение RPC аденовирусными векторами, экспрессирующими активную и неактивную формы белка протеинкиназы C. Затем проанализируйте различные митохондриальные функции и жизнеспособность клеток, чтобы определить влияние изофермента на способность митохондрий синтезировать ATP и предотвращать гибель клеток. Также проведите иммуноблот-анализ фосфорилированной и общей протеинкиназы C эпсилон в совместно полученных клеточных лизатах.

Результаты показывают, что активация протеинкиназы epsilon отрицательно регулирует способность митохондрий вырабатывать ATP, снижает клеточные уровни ATP и жизнеспособность клеток проксимальных канальцев почек. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими методами, такими как использование клеточных линий, является то, что первичные культуры клеток проксимальных канальцев почек сохраняют дифференцированные функции и окислительный метаболизм проксимальных канальцев. Поскольку протеинкиназы могут использоваться в качестве мишеней и потенциальных терапевтических агентов, применение данного метода распространяется на терапию, направленную на предотвращение повреждения почек или ускорение их восстановления после повреждения.

Данный метод позволяет изучить механизмы повреждения и восстановления. Он также может быть применен следующим образом: свежевыделенные почки кролика последовательно промывают 50 миллилитрами стерильной среды D-M-E-M-F 12, стерильного фосфатно-солевого буферного раствора (pH 7.4) и раствора оксида железа в PBS для получения коркового вещества каждой почки.

Сначала гомогенизируйте ткань с помощью гомогенизатора объемом 15 мл. Затем пропустите гомогенат через два стерильных ячеистых сита в стерильный стакан объемом 1 литр. Промойте клетки, оставшиеся на ситах, буфером, содержащим дефероксамин.

Перенесите остатки ткани с дна сита с размером пор 85 мкм в коническую центрифужную пробирку, содержащую 40 мл буфера с дефероксамином. Осторожно перемешайте суспензию клеток с помощью сильного магнита.

Соберите насыщенные железом клубочки и аспирируйте железо, притянутое к магниту. Доведите объем клеточной суспензии до 40 миллилитров и добавьте один миллилитр среды для дигестии, содержащей коллагеназу. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 17 минут.

Осторожно перемешайте суспензию. Соберите клетки путем центрифугирования при 50 ×g в течение двух минут при температуре 4 °C после нескольких промывок. Ресуспендируйте клеточный осадок в 46 мл среды без глюкозы.

Первичные РТ ПК культивируют при плотности один миллиграмм белка на чашку в двух миллилитрах среды D-M-E-M-F 12 без глюкозы на орбитальном шейкере при 37 °C и 5% carbon dioxide. После замены среды проводят инфицирование конфлюэнтных клеток RPT аденовирусом, несущим кДНК либо конститутивно активной протеинкиназы C epsilon, либо доминантно-негативной протеинкиназы C epsilon; инкубируют в течение 24 часов, затем заменяют среду и культивируют трансфицированные первичные RPC еще 24 часа. Для визуализации митохондриальной морфологии монослоя первичных клеток заменяют среду, добавляют MIT tracker red 580 и возвращают чашки в инкубатор на 30 минут.

Затем исследуйте живые монослои с помощью флуоресцентного микроскопа, используя объектив с водяной иммерсией. Два. Для оценки митохондриальной функции определите дыхание в состоянии 3 суспензии RPTC в камере потребления кислорода, оснащенной электродом Кларка.

Сначала измерьте дыхание в состоянии 2 в отсутствие фосфорилирующего агента (ФА). Затем добавьте ФА до конечной концентрации 0,4 мМ. Для инициации дыхания в состоянии 3 перейдите к дыханию в состоянии 4. Добавьте олигомицин до конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

Также проведите измерение разобщенного дыхания, добавив 0,5 µM FCCP к клеткам, находящимся в состоянии three. Медленно добавьте 20 µL 0,5 mM раствора JC-1 в каждую чашку с культурой RPTC и аккуратно перемешайте круговыми движениями для тщательного распределения красителя. Верните чашки в инкубатор на 30 минут.

Затем поместите культуры на лед и проведите две промывки ледяным PBS. После этого соберите клетки. Перенесите клетки RPT в микроцентрифужную пробирку и путем пипетирования разбейте монослои до состояния суспензии одиночных клеток.

Проанализируйте флуоресценцию методом проточной цитометрии, используя возбуждение аргоновым ионным лазером с длиной волны 488 нанометров. Затем рассчитайте митохондриальный мембранный потенциал изолированных митохондрий. Это позволит оценить целостность дыхательной цепи.

После двухкратной промывки монослоев RPTC ледяным буфером PBS соберите клетки и осадите их путем центрифугирования. Промойте осадок один раз в 1 мл буфера A, затем гомогенизируйте клетки в гомогенизаторе Даунса до тех пор, пока при осмотре под микроскопом не будет видно, что большая часть клеток в гомогенате разрушена. Затем удалите клеточный дебрис путем низкоскоростного центрифугирования.

Осадите неочищенные митохондрии из супернатанта при 15,000 ×g в течение 10 минут при температуре four degrees Celsius и выполните три промывки осадка митохондрий в буфере c. Ресуспендируйте митохондриальный осадок в 50–100 µL рабочего буфера и заморозьте в жидком азоте для последующего анализа активности NADH-убихинон-оксидоредуктазы. Добавьте 500 µL рабочего буфера с необходимыми добавками и митохондрии; также подготовьте холостую пробу, содержащую все добавки, но без митохондрий. Инкубируйте планшет при 30 °C в течение пяти минут с перемешиванием для достижения равновесия.

Затем поместите планшет в спектрофотометр и добавьте по 10 µL 3,25 мМ убихинона в каждую лунку, чтобы запустить реакцию. Регистрируйте абсорбцию при 340 нм в течение трех минут с интервалом в 22 с. В аналогичном анализе измерьте активность цитохром-c-оксидазы, используя восстановленный цитохром C в качестве субстрата для реакции АТФ-синтазы.

Подготовьте смеси для анализа общей активности АФА и активности АФА, нечувствительных к олигомицину, для каждой группы обработки. Инкубируйте образцы в реакционной смеси при 31 °C в течение 10 минут. Запустите реакцию, добавив субстрат ТФ, и инкубируйте при 31 °C в течение пяти минут.

Перенесите 200 µL инкубационной смеси в пробирку, содержащую 50 µL 3 M TCA, и осадите белки на льду в течение 10 минут. Затем осадок отделяют центрифугированием. Далее в 96-луночный планшет внесите по 50 µL каждого стандарта фосфата и по 50 µL супернатанта каждого образца в двух повторностях.

Затем добавьте по 250 µL реагента Самнера в каждую лунку и инкубируйте при 30 °C в течение 15 минут. После этого измерьте оптическую плотность при 595 нм. Промойте монослои RPTC дважды ледяным PBS буфером.

Соберите клетки в 1 mL PBS и перенесите клеточную суспензию в пробирку типа Эппендорф. Осадите образцы RPTC путем центрифугирования и определите содержание ATP с помощью люциферазного метода, используя набор для биолюминесцентного анализа ATP. Для анализа жизнеспособности клеток в чашках диаметром 35 mm используйте пять монослоев RPTC для трех контрольных групп обработки: клеток с признаками осмоса, клеток с признаками апоптоза и контроля без окрашивания (две чашки).

Добавьте 2 µL 50 мМ цисплатина во вторую группу. Добавьте 2 µL 500 мМ трет-бутилгидропероксида. После окрашивания клеток пропидиййодидом, как подробно описано в сопроводительном тексте, промойте монослои связывающим буфером.

Затем окрасьте клетки с помощью ANNEXIN 5, конъюгированного с ZI, как подробно описано в текстовом протоколе. После этого аккуратно соберите клетки и суспендируйте их в 500 µL связывающего буфера, используя резиновый скребок (полисмен).

С помощью пипетки диспергируйте клетки до получения суспензии одиночных клеток и перенесите суспензию в пробирки для проточной цитометрии. Диспергируйте клетки до получения суспензии одиночных клеток. Немедленно приступайте к количественному определению флуоресценции PI и FE методом проточной цитометрии; аденовирусная доставка CD NA, покрывающая конститутивно активный и неактивный мутанты протеинкиназы С эпсилон, приводит к значительному повышению уровней протеинкиназы С эпсилон в RPTC и в митохондриях.

Как и ожидалось, конститутивно активная форма фермента фосфорилирована в RPTC, тогда как доминантно-негативный фермент не фосфорилирован. Присутствие активной протеинкиназы C эпсилон снижает митохондриальное дыхание в RPTC независимо от субстрата, используемого для обеспечения митохондрий энергией. Однако неактивная протеинкиназа C эпсилон не оказывает влияния на митохондриальное дыхание.

Интересно, что активация протеинкиназы C эпсилон в RP TCS снижает активность одного из четырех комплексов. Это снижение дыхания RPTC связано с увеличением митохондриального мембранного потенциала. Доминантно-негативный мутант не оказывает такого эффекта.

Эти изменения также сопровождаются снижением активности ТР-синтазы в митохондриях, выделенных из RPTC с гиперэкспрессией активной протеинкиназы С эпсилон. В результате содержание АТФ в RPTC с гиперэкспрессией активной протеинкиназы С эпсилон снижается; устойчивая активация протеинкиназы С эпсилон оказывает глубокое влияние на морфологию митохондрий, что подтверждается фрагментацией митохондрий.

Активация, но не ингибирование протеинкиназы C, также приводит к изменениям морфологии RPTC, вызывая сморщивание клеток и удлинение выживших клеток. Эти митохондриальные эффекты гиперэкспрессии активной протеинкиназы C epsilon в RPC также коррелировали с гибелью клеток как путем некроза, так и путем апоптоза.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как осуществлять гиперэкспрессию белков в первичных культурах с помощью аденовирусного метода и как оценивать митохондриальную способность к синтезу TP. При должном навыке и правильном выполнении эта процедура может занять четыре часа. Кроме того, не забывайте, что работа с аденовирусами сопряжена с определенным риском, поэтому соблюдайте соответствующие меры предосторожности.