Оценка митохондриальной функции и жизнеспособности клеток в клетках почек гиперэкспрессией протеинкиназы С Изоферменты

В данном эксперименте используется селективная модуляция изоформ протеинкиназы С для определения их митохондриальных и клеточных функций в клетках проксимальных канальцев почек при различных физиологических и патологических состояниях. Сначала выделите первичные клетки проксимальных канальцев почек из коркового вещества почек или RPC, обладающие окислительным метаболизмом, напоминающим метаболизм проксимальных канальцев почек.

In vivo заразите RPC аденовирусными векторами, экспрессирующими активную и неактивную формы протеинкиназы C. Затем проведите анализ различных митохондриальных функций и жизнеспособности клеток, чтобы определить влияние изофермента на способность митохондрий синтезировать ATP и предотвращать гибель клеток. Также выполните иммуноблот-анализ фосфорилированной протеинкиназы C эпсилон в собранных клеточных лизатах.

Результаты показывают, что активация протеинкиназы эпсилон отрицательно регулирует способность митохондрий вырабатывать ATP, что снижает клеточные уровни ATP и жизнеспособность клеток проксимальных канальцев почек. Основным преимуществом данного метода перед существующими методами, такими как использование клеточных линий, является то, что первичные культуры клеток проксимальных канальцев почек сохраняют дифференцированные функции и окислительный метаболизм проксимальных канальцев. Поскольку протеинкиназы могут использоваться в качестве мишеней и потенциальных терапевтических агентов, применение данного метода может быть расширено на терапию, направленную на предотвращение повреждения почек или ускорение их восстановления после травмы.

Этот метод позволяет изучить механизмы повреждения и восстановления. Он также может быть применен к freshly isolated rabbit kidney, которые последовательно промывают 50 миллилитрами стерильной среды D-M-E-M-F 12, стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS), pH 7.4 и раствора оксида железа в PBS для сбора коркового вещества каждой почки.

Сначала гомогенизируйте ткань, используя гомогенизатор объемом 15 мл. Затем пропустите гомогенат через два стерильных сетчатых сита в стерильный стакан объемом 1 л. Промойте клетки, оставшиеся на ситах, буфером, содержащим дефероксамин.

Перенесите остатки ткани с дна сита с размером пор 85 микрон в коническую центрифужную пробирку, содержащую 40 мл буфера с дефероксамином. Осторожно перемешайте суспензию клеток с помощью сильного магнита.

Соберите насыщенные железом клубочки и аспирируйте железо, притянутое к магниту. Доведите объем клеточной суспензии до 40 milliliters и добавьте один milliliter среды для переваривания, содержащей коллагеназу. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 17 минут.

Осторожно перемешайте суспензию. Соберите клетки путем центрифугирования при 50 ×g в течение двух минут при температуре 4 °C после нескольких промывок. Ресуспендируйте осадок клеток в 46 мл среды без глюкозы.

Первичные РПЦ культивируют при плотности один миллиграмм белка на чашку в двух миллилитрах среды D-M-E-M-F 12 без глюкозы на орбитальном шейкере при 37 °C и 5% углекислого газа. После замены среды проводят инфицирование конфлюэнтных РПЦ аденовирусом, несущим кДНК либо конститутивно активной протеинкиназы C ε, либо доминантно-отрицательной протеинкиназы C ε; инкубируют в течение 24 часов, заменяют среду и культивируют трансфицированные первичные РПЦ еще 24 часа. Для визуализации митохондриальной морфологии монослоя первичных клеток заменяют среду, добавляют MitoTracker Red CMXs и возвращают чашки в инкубатор на 30 минут.

Затем исследуйте живые монослои под флуоресцентным микроскопом с использованием объектива для погружения в воду. Два. Для оценки митохондриальной функции определите дыхание в состоянии 3 суспензии RPTC в камере потребления кислорода, оснащенной электродом Кларка.

Сначала измерьте дыхание в состоянии 2 в отсутствие фосфорилирующего агента (DP). Затем добавьте DP до конечной концентрации 0,4 мМ. Для инициирования дыхания в состоянии 3, а затем для дыхания в состоянии 4 добавьте олигомицин до конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

Также проведите измерение разобщенного дыхания, добавив 0,5 мкМ FCCP к клеткам, находящимся в состоянии дыхания три. Медленно добавьте по 20 мкл раствора JC-1 с концентрацией 0,5 мМ в каждую чашку с культурой RPTC и перемешайте круговыми движениями для тщательного распределения красителя. Верните чашки в инкубатор на 30 минут.

Затем поместите культуры на лед и выполните две промывки ледяным PBS. После этого соберите клетки. Перенесите клетки RPT в пробирку типа «эппендорф» и разрушьте монослои до состояния суспензии из отдельных клеток путем пипетирования.

Проанализируйте флуоресценцию методом проточной цитометрии, используя возбуждение аргоновым ионным лазером с длиной волны 488 нм. Затем рассчитайте мембранный потенциал изолированных митохондрий. Это позволит оценить целостность дыхательной цепи.

После двухкратной промывки монослоев RPTC ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS) соберите клетки и осадите их путем центрифугирования. Промойте осадок один раз в одном миллилитре буфера A, затем гомогенизируйте клетки в гомогенизаторе Даунса до тех пор, пока при осмотре под микроскопом не станет видно, что большая часть клеток в гомогенате разрушена. Затем удалите клеточный дебрис с помощью низкоскоростного центрифугирования.

Осадите неочищенные митохондрии из супернатанта центрифугированием при 15 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C и проведите трехкратную промывку осажденных митохондрий в буфере c. Ресуспендируйте митохондриальный осадок в 50–100 µL анализационного буфера и заморозьте в жидком азоте для последующего определения активности NADH-убихинон-оксидоредуктазы. Добавьте 500 µL анализационного буфера с необходимыми добавками и митохондриями; также подготовьте холостую пробу, содержащую все добавки, кроме митохондрий. Инкубируйте планшет при температуре 30 °C с перемешиванием в течение пяти минут для достижения равновесия.

Затем поместите планшет в спектрофотометр и добавьте 10 µL 3,25 мМ убихинона в каждую лунку, чтобы запустить реакцию. Записывайте значение абсорбции при 340 нм в течение трех минут с интервалом в 22 секунды. В аналогичном анализе измерьте активность цитохром С-оксидазы, используя восстановленный цитохром С в качестве субстрата для реакции АТФ-синтазы.

Подготовьте смеси для определения общей активности АФА и активности АФА, нечувствительной к олигомицину, для каждой группы обработки. Инкубируйте образцы в реакционной смеси при 31 °C в течение 10 минут. Запустите реакцию, добавив субстрат ТФ, и инкубируйте при 31 °C в течение пяти минут.

Перенесите 200 µL инкубационной смеси в пробирку, содержащую 50 µL 3 M TCA, и осадите белки на льду в течение 10 минут. Затем осадите белки путем центрифугирования. После этого внесите в 96-луночный планшет по 50 µL каждого стандарта фосфата и по 50 µL супернатанта каждого образца в двух повторах.

Затем добавьте по 250 µL реагента Самнера в каждую лунку и инкубируйте при 30 °C в течение 15 минут. Затем измерьте оптическую плотность при 595 нм. Промойте монослои RPTC дважды ледяным PBS буфером.

Соберите клетки в одном миллилитре PBS и перенесите клеточную суспензию в пробирку типа «эппендорф». Осадите образцы RPTC путем центрифугирования и определите содержание TP с помощью люциферазного метода, используя набор для биолюминесцентного анализа TP. Для анализа жизнеспособности клеток в чашках диаметром 35 миллиметров используйте пять монослоев RPTC для трех контрольных групп обработки: клеток с признаками оноза, клеток с признаками апоптоза и контроля без окрашивания (для двух чашек).

Добавьте два микролитра 50 мМ цисплатина во второй набор. Добавьте два микролитра 500 мМ трет-бутилгидропероксида. После окрашивания клеток пропидия йодидом, как подробно описано в сопровождающем тексте, промойте монослои связывающим буфером.

Затем окрасьте клетки с помощью ANNEXIN 5, конъюгированного с ZI, как подробно описано в текстовом протоколе. После этого аккуратно соберите клетки и суспендируйте их в 500 µL буфера для связывания, используя резиновый скребок (полисмен).

С помощью пипетки диспергируйте клетки до получения суспензии из одиночных клеток и перенесите полученную суспензию в пробирки для проточной цитометрии. Диспергируйте клетки до получения суспензии из одиночных клеток. Немедленно приступайте к количественному определению флуоресценции PI и FE методом проточной цитометрии; аденовирусная доставка CD NA, покрывающая конститутивно активный и неактивный мутанты протеинкиназы C эпсилон, приводит к значительному увеличению уровней протеинкиназы C эпсилон в RPTC и в митохондриях.

Как и ожидалось, конститутивно активная форма фермента фосфорилируется в RP tcs, тогда как доминантно-негативный фермент не фосфорилируется. Присутствие активной протеинкиназы С эпсилон снижает митохондриальное дыхание в RPTC независимо от субстрата, используемого для энергообеспечения митохондрий. Однако неактивная протеинкиназа С эпсилон не оказывает влияния на митохондриальное дыхание.

Интересно, что активация протеинкиназы С эпсилон в RP TCS снижает активность одного из четырех комплексов. Это снижение дыхания RPTC связано с повышением потенциала митохондриальной мембраны. Доминантно-отрицательный мутант не оказывает такого эффекта.

Эти изменения также сопровождаются снижением активности ТР-синтазы в митохондриях, выделенных из RPTC с гиперэкспрессией активной протеинкиназы С эпсилон. В результате содержание АТФ в RPTC с гиперэкспрессией активной протеинкиназы С эпсилон снижается. Стойкая активация протеинкиназы С эпсилон оказывает глубокое воздействие на морфологию митохондрий, что подтверждается фрагментацией митохондрий.

Активация, но не ингибирование протеинкиназы C. Это также приводит к изменениям морфологии RPTC, вызывая сморщивание клеток и удлинение выживших клеток. Эти митохондриальные эффекты гиперэкспрессии активной протеинкиназы C эпсилон в RPC также коррелировали с гибелью клеток как путем некроза, так и путем апоптоза.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как осуществлять сверхэкспрессию белков в первичных культурах с помощью аденовирусного метода и как оценивать митохондриальную способность к синтезу TP. При должном освоении эта процедура может быть выполнена за четыре часа при правильном подходе. Не забывайте, что работа с аденовирусами сопряжена с определенными рисками, поэтому соблюдайте соответствующие меры предосторожности.