Простой протокол для опосредованного тромбоцитами слипания Малярийного плазмодия-Инфицированных эритроцитов в условиях ограниченных ресурсов Настройка

Эта процедура предлагает некоторые стандартизированные рекомендации по проведению опосредованных тромбоцитами анализов комкования клинических или лабораторных изолятов ложных паремов плазмодия. Сначала соберите кровь у инфицированного пациента и соберите паразитированные эритроциты с помощью центрифугирования, затем культивируйте и очистите бесполые зрелые стадии. Затем соберите кровь у здорового донора с целью подготовки и стандартизации обогащенной тромбоцитами плазмы путем центрифугирования.

Объедините тромбоциты и паразитированные эритроциты для анализа на комку. Скажем, результаты иммунофлуоресцентной микроскопии могут показать скопления P Fal sperum, опосредованные тромбоцитами. Этот метод специально разработан для измерения фенотипа комкования plasmodium sra.Клинические

изоляты в условиях ограниченных ресурсов. Сообщается, что минимальные вариации в процедурах были направлены на увеличение влияния на исход комковащейся кислоты в полевых условиях. В цитрате натрия вакутайнер собирает примерно пять миллилитров цельной крови у небольного малярией хозяина или 2,5 миллилитра крови у пациентов с КМ или СМ малярией.

Центрифугируйте цельную кровь при давлении 250 г в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем осторожно переложите мутную надосадочную жидкость в чистую 15-миллилитровую трубку. Помните, что тромбоциты легко активируются под действием температуры, колебаний и физических ударов.

Перечислите суспензию PRP с помощью раздражающего бауэра, гемоцитометра и отрегулируйте до нужной концентрации с помощью PBS для получения бедных тромбоцитами плазменных гранул, большинство тромбоцитов из части фракции PRP путем центрифугирования при 1500 GS в течение 10 минут. Храните фракции PRP и PPP при температуре четыре градуса Цельсия от восьми до 10 дней. В идеале для анализа на комкование следует использовать свежие тромбоциты.

Трижды промойте гранулированные периферические эритроциты пятью-10 миллилитрами RPMI 1640 в колбе для культур Дополните PRBC стандартной культурой малярии, средними и свежими неинфицированными эритроцитами для достижения 5% гематокрита. Пропитайте колбы с культурой смесью 92,5% азота, 2,5% кислорода и 5% углекислого газа. Затем пломбирование и посев на зрелых паразитов у пациента ПБК.

Инкубируйте колбу с культуральными культурами в течение от 24 до 36 часов в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислом газе. Нанесите примерно от 10 до 15 микролитров крови на один конец предметного стекла из матового стекла, лежащего на плоской поверхности. Коснитесь капли крови краем второго предметного стекла, пока кровь не равномерно распределится по краю второго предметного стекла, удерживая второе предметное стекло под углом 45 градусов.

Быстро, но аккуратно, не оказывая слишком большого давления на первое предметное стекло, равномерно распределите кровь по первому предметному стеклу. Затем высушите тонкую пленку крови на воздухе, обезвожьте область образца метанолом в течение 10 секунд. Затем обсушите на воздухе, погрузите образец на 2% кеем.

Выдержите не менее 10 минут. Тщательно промойте, пока вода не станет прозрачной и не высохнет на воздухе. Исследуйте образцы под линзой 100-кратной масляной эмульсии на световом микроскопе.

Далее очистите и синхронизируйте зрелый парум PFS, PRBC, как описано в текстовом протоколе. Все переложите культуру в чистую, стерильную 15 миллилитровую пробирку. Гранулируйте ячейки центрифугированием при комнатной температуре при 370 GS в течение пяти минут.

Теперь осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. Затем ресуспендируйте клетки таким образом, чтобы одна половина от общего объема представляла собой плавильное желе. Одна треть второй половины – это безбелковая среда, а две трети второй половины – ПБК.

Переложите суспензию в стерильную 15-миллилитровую пробирку и инкубируйте от 15 до 20 минут в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия до образования четкой границы между верхним и нижним уровнями. Осторожно переложите верхний слой в свежую стерильную 15-миллилитровую пробирку и добавьте 10 миллилитров свежей центрифуги RPMI при давлении от 370 до 430 GS на пять минут. Затем аккуратно выбросьте надосадочную жидкость.

Теперь оцените разбор и стадию развития по жидкому мазку крови и исследуйте под световым микроскопом, как описано ранее. Отрегулируйте полученную после флотации плазменным гелем суспензию P RBC до 10 до восьмой P эритроцитов на микролитр в свежей пробирке объемом 1,5 миллилитра. Мы суспендируем ПБК в концентрации 5% гематокрита и апельсина или бромида атерия в концентрации 20 мкг на миллилитр, конечная концентрация и PRP в концентрации 10% от общего объема.

Аналогичным образом, приготовьте следующие контрольные неинфицированные эритроциты и PRP и PRBC с PPP, чтобы выяснить роль тромбоцитов в комковании PBC. Теперь переложите суспензию в двухмиллилитровый флакон с винтовой крышкой. Поместите флакон под осторожное перемешивание, прокатывая с температурой от 10 до 12 RRP при отборе проб при комнатной температуре с интервалом от 15 до 20 минут в общей сложности на 120 минут, чтобы проверить образование комков.

Пипеткой 10 мкл образца наносят на предметное стекло и накрывают стеклянной прокладкой для исследования под флуоресценцией, Комок рассматривается как совокупность трех или более инфицированных эритроцитов. В этом эксперименте было проверено примерно 70% зрелых стадий pFALs, паремных после обогащения плазменным гелем флотационные комки, легко обнаруживаемые под микроскопом, как и при нормальном освещении. Они проявляются в виде клеточных агрегатов и при флуоресценции в виде зеленых или красных пятен.

При окрашивании акро и апельсином или атерием бромид погибает соответственно. Размер комков значительно увеличивается в среднем до более чем 15 пбк на комок после инкубации в течение 120 минут, при этом некоторые комки содержат большое количество пбк на комок, которые не могут быть визуально подсчитаны. Частота фенотипа комкования рассчитывается как количество инфицированных клеток, присутствующих в сгустках, на 1000 инфицированных клеток, подсчитанных в повторяющихся анализах.

После просмотра этого видео у вас теперь должно быть четкое представление о том, как проводить plasmodium falciparum, опосредованный тромбоцитами анализ комкования. Будьте осторожны, чтобы не активировать тромбоциты при резких движениях и колебаниях температуры. Этот анализ также может быть применен для измерения опосредованного тромбоцитами анализа комкования при тяжелой малярии.