Простой протокол для опосредованного тромбоцитами слипания

В данной процедуре представлены стандартизированные рекомендации по проведению анализа агрегации, опосредованной тромбоцитами, для клинических или лабораторных изолятов Plasmodium falciparum. Сначала необходимо взять кровь у инфицированного пациента и выделить паразитированные эритроциты путем центрифугирования, затем культивировать и очистить зрелые бесполые стадии. Далее следует взять кровь у здорового донора для подготовки и стандартизации обогащенной тромбоцитами плазмы с помощью центрифугирования.

Объедините тромбоциты и зараженные эритроциты для проведения анализа на агрегацию. Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии могут продемонстрировать агрегаты P. falciparum, опосредованные тромбоцитами. Данный метод специально разработан для оценки фенотипа агрегации plasmodium sra.

Клинические изоляты в условиях ограниченных ресурсов. Сообщалось, что минимальные отклонения в процедурах могут усилить влияние на результат теста на слипание кислоты (clumping acid) в полевых условиях. В связи с этим возникла необходимость в четком и простом протоколе, адаптированном для условий с ограниченными ресурсами, чтобы стандартизировать процесс на всех полевых участках в эндемичных по малярии районах. В вакутайнер с цитратом натрия соберите примерно 5 мл цельной крови от донора, не болевшего малярией, или 2,5 мл крови от пациентов с церебральной (CM) или тяжелой (SM) малярией.

Центрифугируйте цельную кровь при 250 Gs в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем осторожно перенесите мутный супернатант в чистую пробирку объемом 15 миллилитров. Помните, что тромбоциты легко активируются под воздействием температурных колебаний и физических воздействий.

Подсчитайте количество клеток в суспензии PRP с помощью камеры Горяева (гемоцитометра) и доведите до нужной концентрации с помощью PBS. Чтобы получить осадок плазмы, обедненной тромбоцитами (PPP), центрифугируйте часть фракции PRP при 1500 GS в течение 10 минут для отделения большинства тромбоцитов. Храните фракции PRP и PPP при температуре four degrees Celsius в течение 8–10 дней. Для проведения анализа на агрегацию рекомендуется использовать свежие тромбоциты.

Трижды промойте осадок периферических эритроцитов 5–10 мл среды RPMI 1640 в культуральном флаконе. Дополните PRBC стандартной средой для культивирования малярии и свежими неинфицированными эритроцитами до достижения гематокрита 5%. Продуйте культуральные флаконы смесью из 92,5% азота, 2,5% кислорода и 5% углекислого газа. Затем герметично закройте флаконы и культивируйте зрелые паразиты, полученные из периферической крови пациентов.

Инкубируйте культуральный флакон от 24 до 36 часов в инкубаторе при 37 °C и 5% carbon dioxide. Нанесите примерно 10–15 µL крови на один конец матового предметного стекла, лежащего на плоской поверхности. Приложите край второго предметного стекла к капле крови и, удерживая его под углом 45°, равномерно распределите кровь по краю этого стекла.

Быстро, но осторожно, не оказывая избыточного давления на первое предметное стекло, равномерно распределите кровь по всей его поверхности. Затем высушите тонкую пленку крови на воздухе, обезвоживайте область образца метанолом в течение 10 секунд. После этого снова высушите на воздухе, затем погрузите образец в 2%keem.

Выдержите в течение не менее 10 минут. Тщательно промойте до тех пор, пока вода не станет прозрачной, и высушите на воздухе. Изучите образцы под световым микроскопом, используя иммерсионный объектив с увеличением 100 x.

Затем очистите и синхронизируйте зрелые PFS parum, PRBC, как описано в текстовом протоколе. Перенесите всю культуру в чистую стерильную пробирку объемом 15 миллилитров. Осадите клетки путем центрифугирования при комнатной температуре при 370 GS в течение пяти минут.

Теперь осторожно аспирируйте супернатант, не затрагивая осадок. Затем ресуспендируйте клетки таким образом, чтобы одна половина общего объема составляла jello fusing. Одна треть второй половины должна быть представлена безбелковой средой, а две трети второй половины — pbcs.

Перенесите суспензию в стерильную пробирку объемом 15 мл и инкубируйте в течение 15–20 минут в инкубаторе при 37 °C до образования четкой границы между верхним и нижним слоями. Осторожно перенесите верхний слой в новую стерильную пробирку объемом 15 мл, добавьте 10 мл свежей среды RPMI и центрифугируйте при 370–430 ×g в течение пяти минут. Затем осторожно удалите супернатант.

Теперь оцените степень паразитарности и стадию развития с помощью мазка тонкой капли крови, исследуя его под световым микроскопом, как было описано ранее. Доведите концентрацию суспензии P RBC, полученной после флотации плазменным гелем, до 1 × 10⁸ P RBC на микролитр в новой пробирке объемом 1,5 мл. Мы суспендируем P RBC при гематокрите 5% в растворе анилового оранжевого или бромида этиридия с конечной концентрацией 20 µg/mL и PRP в объеме 10% от общего объема.

Аналогичным образом подготовьте следующие контрольные образцы: неинфицированные эритроциты, а также PRP и PRBC с PPP, чтобы определить роль тромбоцитов в агрегации PBC. Теперь перенесите суспензию в виалу с завинчивающейся крышкой объемом 2 мл. Поместите виалу в условия мягкого перемешивания путем перекатывания при 10–12 RRP при комнатной температуре, отбирая пробы с интервалом 15–20 минут в течение общего времени 120 минут для проверки образования агрегатов.

Пипетируйте 10 µL образца на предметное стекло и накройте покровным стеклом для исследования под флуоресцентным микроскопом. Сгусток считается агрегатом из трех или более инфицированных эритроцитов. В данном эксперименте анализировалось примерно 70% зрелых стадий p FALs парем после обогащения методом флотации в плазменном геле; сгустки легко обнаруживаются под микроскопом даже при обычном освещении. Они выглядят как клеточные агрегаты, а при флуоресценции — как зеленые или красные точки.

При окрашивании красителями акридином и оранжевым или бромидом этеридия соответственно размер конгломератов значительно увеличивается до среднего значения более 15 pbcs на конгломерат после инкубации в течение 120 минут, при этом некоторые конгломераты содержат многочисленные pbcs, которые невозможно было подсчитать визуально. Частота фенотипа агрегации рассчитывается как количество инфицированных клеток в конгломератах на 1000 инфицированных клеток, подсчитанных в дублирующих анализах.

После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как проводить анализ тромбоцитарной агрегации, опосредованной Plasmodium falciparum. Будьте осторожны, чтобы не активировать тромбоциты резкими движениями и перепадами температуры. Данный анализ также может быть применен для измерения тромбоцитарной агрегации при тяжелой форме малярии.