Использование времени Lapse микроскопии для визуализации Anoxia вызванных Подвесные анимации в

Общая цель данной процедуры — описать метод визуализации субклеточной динамики in vivo в эмбрионах sea elegance, подвергнутых аноксии, с использованием установки с газовым потоком на высокомощном микроскопе. Для этого сначала подготавливают образец молодых взрослых трансгенных животных, чтобы получить подходящую популяцию молодых эмбрионов для визуализации. Затем готовят тонкие предметные стекла с agarose pad для использования в микроинкубационной камере.

Затем особей sea elegance надлежащим образом анестезируют и покрывают галокарбоновым маслом, чтобы предотвратить высыхание при воздействии потока газа. В завершение круглое покровное стекло с анестезированными животными помещают в микроинкубационную камеру. Камера устанавливается на предметный столик микроскопа и заполняется азотом для создания аноксической среды во время визуализации, что в конечном итоге осуществляется за счет подачи потока газа через микроинкубационную камеру.

В сочетании с флуоресцентной микроскопией in vivo данный метод позволяет получать детальные видеозаписи и изображения высокого разрешения, демонстрирующие остановку клеточного цикла в ответ на аноксию. Основным преимуществом этой техники перед существующими методами, такими как непрямая иммунофлуоресценция, является возможность документировать субклеточные изменения in vivo в то время, когда животные подвергаются воздействию специфических условий. Таким образом, данный метод позволяет получить представление о состоянии индуцированного аноксией анабиоза у эмбрионов elegans.

Данный метод также может быть применен к другим системам, таким как дрожжи, клеточные культуры или эмбрионы других мелких беспозвоночных и позвоночных животных. Также могут быть применены дополнительные условия, такие как гиперoксия, воздействие температуры, стресс или обработка низкомолекулярными соединениями. Эту процедуру демонстрируют Анастасия Гарсия и Мэри Латт, два аспиранта моей лаборатории. Начните с подходящего трансгенного штамма C. elegans, представляющего интерес; в данном исследовании будет использован трансгенный штамм TH 32 для визуализации хромосом и центросом в качестве маркеров клеточного деления.

Для получения синхронизированной популяции подвергните взрослых особей воздействию раствора гипохлорита для их дезинтеграции, после чего используйте оставшиеся эмбрионы, перенеся взрослых особей на посеянную чашку и оставив их для откладки яиц на один-два часа, либо перенесите личинок стадии L4 из смешанной популяции на новую посеянную чашку. Выращивайте нематод при 20 °C до стадии раннего взрослого возраста, что займет примерно 96 часов с момента вылупления, 72 часа с стадии личинки L1 или 24 часа после линьки L4. Данная методика позволяет получить популяцию молодых взрослых особей с большим количеством ранних эмбрионов, которые характеризуются крупными бластомерами и ядрами, что является оптимальным для визуализации субклеточных и субъядерных изменений.

Для подготовки влажной камеры для хранения подготовленных предметных стекол поместите влажное бумажное полотенце в большую чашку Петри или контейнер, накрытый крышкой подходящего размера. Приготовьте расплавленный 2% aros в деионизированной воде, нагревая смесь в стеклянной посуде с помощью микроволновой печи или водяной бани. Затем нанесите от одной до трех капель теплого aros на чистое предметное стекло; немедленно поместите второе стекло сверху на капли aros в перевернутом перпендикулярном положении и слегка нажмите, чтобы получившаяся прокладка была тонкой и не содержала пузырьков воздуха.

После медленного охлаждения арос аккуратно разделите два предметных стекла, оставив подушку ароса на одном из них. Важно убедиться, что подушка ароса достаточно тонкая, чтобы не препятствовать фокусировке микроскопа. Позже с помощью чистого лезвия бритвы обрежьте подушку ароса, придав ей форму небольшого квадрата.

Предметные стекла хранят в подготовленной влажной камере до начала использования. С помощью того же чистого лезвия бритвы осторожно захватите край экспланта и перенесите его с предметного стекла на кругное микропокрывное стекло диаметром 25 миллиметров. Чтобы избежать образования пузырьков воздуха под кругным покрывным стеклом, оно должно плотно прилегать и соответствовать параметрам микроинкубатора.

Нанесите одну каплю анестетика на подушечку для агароза. Возьмите от пяти до 10 червей и поместите их в каплю анестетика. Подождите от одной до трех минут, пока черви не перестанут двигаться.

С помощью наконечника пипетки нанесите каплю галокарбонового масла поверх червей, чтобы предотвратить их обезвоживание при пропускании газа через камеру. Затем подсоедините один конец гибкой пластиковой трубки к камере. Разделите две половины закрытого перфузионного микроинкубатора и осторожно установите покровное стекло вертикально на нижнее кольцо.

Плотно закройте две стороны камеры. Затем подключите камеру к баллону с азотом с помощью гибкой пластиковой трубки и поместите ее на предметный столик микроскопа. Проверьте отсутствие утечек, убедившись в надежности крепления трубки и заглушек портов по бокам камеры для визуализации эмбрионов.

Сначала найдите животных при малом увеличении. Затем перейдите к соответствующему большему увеличению. Для визуализации эмбриональных blasphemers у взрослых особей используйте лазер с длиной волны 488 нанометров, чтобы обнаружить GFP-слитый белок в интересующих клетках.

Чтобы визуализировать определенную стадию остановки клеточного цикла, например, позднюю профазу, выберите объект на более ранней стадии клеточного деления, такой как поздняя интерфаза или ранняя профаза. Перфузируйте камеру азотом и продолжайте наблюдение за объектами по мере заполнения камеры азотом, при необходимости корректируя фокальную плоскость. Проведите таймлапс-съемку, чтобы зафиксировать интересующий в данном случае феномен.

Остановка в профазе и прикрепление хромосом к внутренней ядерной мембране. Выполняйте снимки каждые 10 секунд в течение до 30 минут. Обычно аноксия-индуцированная остановка в профазе происходит в течение 20–30 минут после начала подачи потока азота.

Чтобы зафиксировать восстановление после состояния покоя, вызванного аноксией, перекройте подачу газа и дайте камере вернуться к нормоксии, записывая серию кадров в режиме таймлапс. Возобновление клеточного цикла и расплетение хромосом обычно происходит в течение от 5 до 20 минут. Используйте ImageJ или Photoshop для обработки изображений и видео, а затем импортируйте их в QuickTime для демонстрации.

В эмбрионе, подвергнутом аноксии, хромосомы профазы конденсируются и выстраиваются вдоль внутренней периферии ядра. Это явление называют «докингом» хромосом; при реоксигенации клеточный цикл возобновит свое развитие, и хромосомы профазы вернутся в исходное состояние.

Blasphemy переместится от ядерной периферии к экваториальной пластинке, что будет указывать на переход в метафазу. После освоения эта техника может быть выполнена за три-четыре часа с использованием животных на соответствующих стадиях развития. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использовать только здоровых молодых взрослых животных, чтобы выделить достаточно времени для завершения эксперимента, а также проявлять терпение при обучении выбору blasphemers на подходящих стадиях.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как фиксировать события на субклеточном уровне, индуцированные аноксией in vivo, используя эмбрионы GaN и камеру с протоком газа на высокомощном микроскопе.