Общая цель данной процедуры заключается в регистрации электрической активности нервов, мышц и нейронов, а также соответствующих движений feeding apparatus во время выполнения моторных программ питания. Это достигается путем предварительного извлечения buccal mass из анестезированной plegia и прикрепления крючковидных электродов к ключевым нервам и мышцам. На втором этапе buccal mass помещают в чашку для регистрации и подготавливают ганглии для внеклеточной регистрации.

Затем с помощью внеклеточных электродов определяют местоположение целевых нейронов. Заключительным этапом является индукция и запись моторных программ питания, таких как кусание, глотание и отторжение. В конечном итоге препарат подвешенной буккальной массы используется для демонстрации активности нервов, мышц и отдельных нейронов во время различных движений буккальной массы, имитирующих процесс питания.

Главным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как исследования изолированных ганглиев, является то, что записи с нервов, мышц и отдельных нейронов могут быть напрямую соотнесены с движениями пищевого аппарата. В демонстрации процедуры поможет хуу, аспирант нашей лаборатории. Для начала процедуры анестезируйте здоровую плегию весом от 200 до 300 г в диссекционном лотке, введя изотонический хлорид магния в количестве примерно 50% от массы тела животного. После первого введения препарата в область хвоста осторожно помассируйте поверхность тела животного, чтобы распределить хлорид магния.

При необходимости сделайте дополнительные инъекции в области головы животного. После того как животное перестанет реагировать на легкие тактильные раздражители, зафиксируйте его булавками на лотке спинной стороной вверх. Установите одну булавку в хвост и по одной булавке в каждое переднее щупальце.

Затем с помощью пинцета зажмите и приподнимите кожу животного в средней части головы. Позади ринофор сделайте корональный разрез поперек головы животного сразу за точкой захвата. После этого сделайте срединный сагиттальный разрез между ринофорами в направлении рта, чтобы обнажить буккальную массу.

Затем оттяните кожный лоскут от буккальной массы и перережьте нервы и соединительную ткань, прикрепляющие его к стенке тела. Чтобы полностью отделить этот кожный лоскут от буккальной массы, следите за тем, чтобы не повредить нервы или ткани, находящиеся внутри буккальной массы. После этого захватите и удерживайте пищевод.

Перережьте пищевод позади удерживаемой точки. Подтяните пищевод вверх и приподнимите щечную массу за этой массой. Церебральные, плевральные и педальные ганглии образуют кольцо, при этом церебральный ганглий прикреплен к щечным ганглиям посредством церебрально-буккальных комиссур.

Оставьте эти кольцевидные ганглии прикрепленными к бульбулярной массе и перережьте все нервы, идущие от этих ганглиев к другим частям тела. Затем прорежьте соединительную ткань вокруг бульбулярной массы и продолжайте приподнимать её по мере того, как она будет отделяться от тела. Когда бульбулярная масса останется прикрепленной только к ротовому отверстию, зафиксируйте пищевод и бульбулярную массу.

Сделайте прямой разрез. Выполните окончательный разрез непосредственно перед челюстями, чтобы отделить ротовую массу от тела. Поместите ротовую массу в раствор, состоящий из 50% изотонического раствора хлорида магния и 50% физиологического раствора SIA, чтобы поддерживать частичную анестезию во время подсоединения электродов.

Затем поместите буккальную массу с раствором в чашку Петри с плоским дном, сделав разрез по буккальной артерии на вентральной поверхности буккальной массы. После этого удалите плевральные и педальные ганглии, перерезав их связи с церебральным ганглием. Оставьте церебральный ганглий прикрепленным к буккальным ганглиям и буккальной массе через соединительные комиссуры (CBCs), и перережьте остальные связи между церебральным ганглием и буккальной массой.

Обрежьте пищевод и слюнные железы до короткой длины. На этом этапе закрепите крючковидные электроды на глазке ульнарного нерва, втором и третьем мышечных щечных нервах, а также на ветви A второго щечного нерва. Используйте процедуру, аналогичную той, что продемонстрирована в публикации JoVE Коллинза и Шилда и кратко описана здесь.

При каждом отделении электрода расположите электрод рядом с нервом или мышцей, поместите целевой нерв в крючок и аккуратно поднимите его с помощью манипулятора. Затем промокните участок нерва салфеткой Kim wipe. Нанесите каплю быстросохнущего суперклея с гелеобразным наполнителем на захваченный крючком нерв; убедитесь, что крючок полностью покрыт клеем, а кончик контрольного провода остался чистым.

Затем с помощью шприца с полиэтиленовой трубкой нанесите раствор из чашки на клей, что приведет к затвердеванию поверхности клея. Следующим шагом является подготовка круглой recording dish из Pyrex размером 100 на 50 millimeter для использования в качестве регистрирующей камеры; с помощью наконечника пипетки нанесите тонкий слой вакуумной смазки в выемку между церебральной и изогнутой камерами, чтобы минимизировать утечку. Затем заполните переднюю камеру физиологическим раствором для plescia.

Осторожно перенесите буккальную массу из чашки Петри в переднюю камеру круглой чашки Pyrex, следя за тем, чтобы электроды не были натянуты, так как это может привести к разрыву нервов. Будьте предельно осторожны с крючкообразными электродами, если чашку необходимо перенести под другой бинокулярный диссекционный микроскоп. Для истончения оболочки.

Сгруппируйте электроды с каждой стороны ротового аппарата. Осторожно удерживайте электроды, захватив лабораторный скотч, который закрывает контактные штырьки, и снова убедитесь, что ни один из электродов не натянут. Когда чашка будет помещена под микроскоп, электроды должны аккуратно свисать по краям чашки и лежать на платформе во время перерывов и между этапами эксперимента; аэрируйте физиологический раствор в камере с ротовым аппаратом с помощью аквариумного аэратора.

Затем закрепите церебральный ганглий в задней камере, пропустив CBC через вырез. Нанесите дополнительно вакуумную смазку поверх CBC. После этого добавьте больше физиологического раствора SIA в обе части чашки, чтобы ганглии были полностью погружены.

Убедитесь, что уровень физиологического раствора ниже уровня вакуумной смазки между церебральной и буккальной камерами, чтобы предотвратить утечку между камерами. На этом этапе буккальная масса должна находиться на дне передней камеры. Затем зафиксируйте буккальные ганглии на средней платформе с помощью булавок, чтобы не повредить нервы, все еще прикрепленные к буккальной массе.

Устанавливайте булавки только на оболочку между двумя нервами. Затем добавьте еще две булавки по бокам от CBC, чтобы растянуть и зафиксировать их. Держите буккальные ганглии в плоском положении или разверните их в зависимости от расположения интересующих нейронов.

Чтобы повернуть буккальный ганглий, с помощью тонкого пинцета захватите избыток оболочки CBC и закрепите его булавкой между вторым и третьим буккальными нервами. После этого станет видно большинство тел клеток, расположенных рядом с задней камерой, к которым трудно получить доступ сверху буккального ганглия. В завершение установите две булавки в оболочку буккального ганглия со стороны буккальной массы.

Чтобы свести к минимуму смещение буккального ганглия, захватите оболочку буккального ганглия рядом с задней камерой и аккуратно обрежьте излишки оболочки тонкими ножницами, не обнажая тела клеток. Для минимизации повреждений удаляйте только тот объем оболочки, который необходим для визуализации тел клеток после завершения процедуры истончения оболочки. Подсоедините все контакты электродов к соответствующим гнездам на кабелях, подключенных к усилителям.

Убедитесь, что электроды не натянуты слишком сильно, правильно подключены к соответствующим кабелям и соблюдена правильная полярность для вымывания остатков хлорида магния. Замените физраствор SIA в камере щечной массы свежим физраствором SIA. Затем проведите шелковую нить через мягкие ткани в передней части щечной массы, дорсально по отношению к хрящу челюсти.

Используйте два кусочка модельного пластилина, чтобы закрепить шовный материал на краю чашки, тем самым подвешивая буккальную массу за ее передний конец. С помощью манипулятора удерживайте стеклянный внеклеточный электрод так, чтобы кончик электрода находился рядом с буккальным ганглием. Чтобы найти и идентифицировать нейрон, осторожно опустите кончик внеклеточного электрода на оболочку.

Над сомой нейрона. Подайте стимулирующий ток, после чего переключите канал, используемый для возбуждения сомы, в режим записи, чтобы зарегистрировать активность на внеклеточном электроде и соответствующую активность на нервах для индукции отторжения. Подобно моторным программам, стимулируйте буккальный нерв 2A длинной серией импульсов частотой 2 Hz длительностью 1 ms для генерации паттернов ees.

Паттерны сохраняются на протяжении всего периода стимуляции и могут продолжаться некоторое время после ее прекращения. Для индукции моторных программ, подобных кусанию, поместите несколько кристаллов твердого вещества caracol непосредственно на церебральный ганглий.

Повторяющиеся паттерны обычно начинаются в течение пяти минут и длятся примерно от 10 до 15 минут, после чего их интенсивность снижается, вызывая глотание. По аналогии с моторными программами, примените стимуляцию каракóла и дождитесь, пока буккальная масса начнет совершать сильные захваты. Затем, во время захвата, поместите полоску морских водорослей в рот животного так, чтобы оно захватило водоросли.

На данной записи представлены стимуляция и регистрация активности идентифицированного мотонейрона B9, а также запись с этого же нейрона, мышцы I2 и нескольких нервов во время выполнения программ моторного питания. Здесь представлены видеоизображения, полученные из этой же серии моторных программ. Паттерны глотания индуцировали путем нанесения карбахола на церебральный ганглий с последующим помещением полоски морских водорослей в захват во время индуцированного карбахолом кусания.

На этом изображении радула выдвинута для захвата водорослей, а на этом — радула втянута, затягивая водоросли в рот. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как подготовить подвешенную ротоглоточную массу и получить записи двигательных программ питания in vitro.