Проточной цитометрии Выделение первичных мышиных Type II альвеолярных эпителиальных клеток для функционального и молекулярных исследований
26 декабря 2012 г.
Мы описываем быстрого выделения первичных мышиных тип II альвеолярных эпителиальных клеток (AECII) методом проточной цитометрии отрицательного отбора. Эти AECII показывают высокую жизнеспособность и чистоты и подходят для широкого спектра функциональных и молекулярных исследований в отношении их роли в респираторных заболеваний, таких как аутоиммунные и инфекционные заболевания.
Общая цель данной процедуры заключается в выделении чистых и жизнеспособных первичных альвеолярных эпителиальных клеток второго типа для последующего функционального и молекулярного анализа. Сначала в легкое и трахею умершей мыши вводят раствор DYS, а затем агарозу. После того как диспаза переварит ткань легкого, орган извлекают.
Ткань подвергают ручной дезинтеграции. Полученную суспензию фильтруют через серию сит с постепенно уменьшающимся размером пор. Затем с помощью метода негативной селекции проточной цитометрии выделяют окрашенные эпителиальные клетки альвеол 2-го типа.
В конечном итоге, выделенные альвеолярные эпителиальные клетки второго типа могут быть использованы для проведения функциональных и молекулярных анализов с целью изучения их роли при респираторных инфекциях и некоторых аутоиммунных заболеваниях. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области иммунных реакций легких, особенно в контексте аутоиммунных заболеваний легких и вирусных инфекций. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как подготовка органа и клеточной суспензии требует специального навыка.
Общий успех данного протокола зависит от нескольких важных деталей при выполнении этих этапов. Для каждой мыши в эксперименте предварительно прогрейте 15-миллилитровую пробирку, содержащую 4 мл DYS bays, на водяной бане при 37 °C. Поместите небольшие аликвоты 1% low. Mel Aros в воде в нагревательный блок при 95 °C до полного разжижения. Затем охладите их до 45 °C и поддерживайте эту температуру до момента их дальнейшего использования.
Для подготовки легких мыши возьмите животное, подвергнутое эвтаназии путем асфиксии CO2. Обработайте этанолом. Выполните длинный разрез вдоль вентральной срединной линии тела.
Затем оттяните кожу на вентральной поверхности и осторожно разрежьте и удалите брюшину. После обескровливания мыши аккуратно проколите и удалите диафрагму, после чего срежьте ребра. Чтобы обнажить сердце и легкие, будьте особенно осторожны, чтобы не повредить легкое, используя канюлю 26 gauge и шприц объемом 10 milliliter, заполненный холодным раствором.
Проколите правый желудочек сердца и перфузируйте легкие раствором PBS до полного удаления крови. Разрежьте и удалите слюнные железы, чтобы открыть доступ к трахее. Также осторожно рассеките мышцы, окружающие трахею.
Затем введите в трахею периферический катетер 22G. Извлеките иглу и продвиньте пластиковый катетер в сторону легкого. Зафиксируйте катетер, завязав вокруг трахеи и катетера небольшой кусочек нити.
При необходимости подготовьте образец бронхоальвеолярного лаважа, промыв легкие через введенный в трахею катетер с помощью PBS или среды. Храните жидкость для лаважа на льду до проведения дальнейшего анализа. Самым сложным этапом данной процедуры является переваривание и дезинтеграция тканей.
Для успешного выполнения данного протокола необходимо убедиться, что раствор Dispa полностью заполняет все доли легкого после переваривания тканей. Ткани следует дезинтегрировать. Используя шприц объемом 2 мл, осторожно введите в легкое через катетер максимальный объем 2 мл предварительно приготовленного раствора Dispa, чтобы все доли были полностью расправлены. Замените шприц на шприц объемом 1 мл, содержащий 0,5 мл разжиженного Aros, и введите содержимое в легкое.
Оставьте шприц на катетере, чтобы предотвратить обратный ток аэрогеля, и немедленно накройте легкое лабораторной салфеткой и льдом. Оставьте аэрогель на пару минут. Удалите салфетку, лед, шприц и катетер.
Затем перережьте трахею и извлеките из грудной полости легкое, сердце и тимус. Промойте подготовленные органы в кювете с PBS. После этого отделите сердце, тимус и оставшуюся часть трахеи от легкого и утилизируйте их.
Поместите легкое в пробирку, содержащую оставшиеся два миллилитра растворов, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 минут. Проведите инкубацию для обеспечения эффективного блокирования FC-рецепторов фагоцитарных клеток перед процедурой окрашивания. Перенесите легкое из растворов в чашку, содержащую семь миллилитров антител anti CD 1632 в концентрации one microgram per milliliter и 100 microliters DNAs в среде DMEM; с помощью двух пар пинцетов полностью измельчите ткань легкого, разрывая ее на части.
Затем инкубируйте смесь в течение 10 минут при комнатной температуре на ротационном шейкере, установленном на 200 RPM, при необходимости. После этого клеточную суспензию можно хранить при температуре 4 °C до следующего этапа. Пропустите клеточную суспензию через серию нейлоновых фильтров.
Сначала пропустите суспензию через фильтр с размером пор 100 микрон, помещенный на пробирку объемом 50 миллилитров. При объединении образцов пропускайте суспензии клеток мышей одной и той же группы через один и тот же фильтр. Если фильтр засорится, замените его на новый.
Повторите этот процесс с фильтром с размером ячеек 70 мкм. Тщательно промывайте каждую сетку, а также пробирки и чашки средой DMEM, чтобы минимизировать потерю клеток и максимально увеличить выход. Затем пропустите суспензию через фильтр с размером ячеек 48 мкм, натянув его на пластиковое или стеклянное кольцо, как показано здесь.
Соберите фильтрат в чашку Петри. Затем повторите этот процесс, используя сетку с размером ячеек 30 micron. В зависимости от объема перенесите фильтрат в одну или несколько пробирок объемом 50 milliliters и центрифугируйте в течение 15 минут при 160 ×g и температуре four degrees Celsius.
После центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте осадок клеток в двух миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов. Затем быстро прекратите лизис, добавив 13 миллилитров среды DMEM. Перенесите раствор в пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте в течение 12 минут при 160 ×g и четырех градусах Celsius.
Ресуспендируйте клетки в трех миллилитрах коктейля из первичных антител, содержащего антитела против CD 11 C, CD 11 BF четыре 80 CD 19, CD 1632 и CD 45. Инкубируйте клетки в течение 10 минут в темноте при температуре четыре градуса Цельсия или на льду. После инкубации промойте клетки, наполнив пробирку DMEM, и центрифугируйте в течение 12 минут при 160 ×g и четыре градуса Цельсия.
Ресуспендируйте клетки в 1 мл DMEM и проведите предварительную фильтрацию через фильтр с порами 50 мкм в пробирку для сортировки клеток. Подсчитайте количество клеток, чтобы определить общее число клеток в суспензии легкого. Для сортировки клеток EC2 непосредственно перед началом процедуры используйте сопло 100 мкм.
Перемешайте клеточную суспензию с помощью вортексного смесителя. Давление потока, а также длины волн лазерного возбуждения и детектирования зависят от прибора, используемого для проточной цитометрии, и флуорохромов, применяемых при окрашивании антителами. Сначала постройте график зависимости интенсивности бокового светорассеяния (SSC) от интенсивности флуоресценции и выделите гейтом популяцию клеток с высоким уровнем бокового светорассеяния, отрицательных по флуорохромам, использованным для окрашивания.
Затем постройте графики зависимости площади бокового светорассеяния от площади переднего светорассеяния, высоты переднего светорассеяния от площади переднего светорассеяния и высоты бокового светорассеяния от площади бокового светорассеяния; установите гейт для исключения дуплетов или агрегатов клеток при сортировке в пробирку с DMEM. При сортировке суспензий клеток легких, выделенных из здоровых мышей, гейт EC2 обычно охватывает около 42 ± 10% всех событий. Для сбора отсортированных клеток центрифугируйте пробу в течение 20 минут при 280 ×g и 4 °C.
Ресуспендируйте альвеолярные эпителиальные клетки второго типа или EC2 в культуральной среде или буфере, в зависимости от требований последующего анализа. Первичные альвеолярные эпителиальные клетки второго типа мыши были выделены с помощью метода отрицательного отбора с использованием проточной цитометрии, как описано в данном видео; анализ отсортированных клеток представлен здесь, как указано.
Чистота изолированных клеток составляет примерно 92 ± 5%. Сортированные A EC2 были окрашены на сурфактантный белок С; слева представлено изображение, полученное с помощью фазово-контрастной микроскопии, а справа — иммунофлуоресцентное изображение. Было установлено, что почти 100% клеток оказались положительными по сурфактантному белку С, что подтверждает успешную изоляцию чистой популяции. Для оценки эффектов инфекции вирусом гриппа А in vivo клетки A EC2 были изолированы из мышей C 57 BL six, которым внутриносовым путем вводили либо фосфатно-солевой буфер, либо вирус гриппа А PR eight A 34 за один, два или три дня до этого.
На этих графиках представлены суспензии клеток легких неинфицированных и инфицированных в течение трех дней самцов мышей C 57 black six, окрашенные для сортировки с целью изучения привлечения иммунных клеток в инфицированные легкие. Доля флуоресцентно-отрицательных клеток с высоким показателем бокового рассеяния (side scatter) существенно снижена в суспензии клеток, приготовленной от мышей, инфицированных в течение трех дней, по сравнению с неинфицированными мышами. Экспрессия нуклеарного белка вируса гриппа А в отсортированных клетках A2 анализировалась с помощью внутриклеточного окрашивания специфическими антителами к нуклеарному белку.
Гистограмма показывает, что клетки AEC2, выделенные из инфицированных in vivo мышей, дают специфический флуоресцентный сигнал после внутриклеточного окрашивания на нуклеопротеин вируса гриппа А. В таблице представлена средняя интенсивность флуоресценции при окрашивании нуклеарного белка; интенсивность сигнала, возникающего при внутриклеточном окрашивании на нуклеарный белок в клетках AEC2, выделенных из инфицированных вирусом гриппа А мышей, увеличивается по мере продолжительности вирусной инфекции. Это было сделано для подтверждения жизнеспособности клеток AEC2, выделенных из здоровых мышей, и для проверки их восприимчивости к инфекции вирусом гриппа А.
Как показано здесь, также был проведен анализ экспрессии вирусного нуклеарного белка гриппа в изолированных клетках, инфицированных X vivo. Значительная доля EC2 экспрессирует вирусный нуклеарный белок через шесть часов после инфицирования. Эти данные обобщены здесь.
Процент EC2, положительных по результатам внутриклеточного окрашивания на вирусный ядерный белок, зависит от дозы вируса, использованной в эксперименте по инфекции ex vivo. Эти результаты показывают, что изолированные первичные нейроны, EC2, жизнеспособны и восприимчивы к вирусной инфекции и репликации, что оценивалось по наблюдаемой экспрессии вирусного белка. При выполнении данной процедуры крайне важно помнить о необходимости тщательного проведения всех этапов переваривания и дезинтеграции тканей.
Также очень важно помнить о необходимости строгого установления гейта по флуоресцентно-отрицательным клеткам и области с высоким содержанием сайд-популяционных клеток. После сортирования по данной процедуре можно применить другие методы, такие как молекулярные и функциональные исследования, чтобы исключить роль альвеолярных макрофагов 2-го и 3-го типов в контексте вирусных инфекций и аутоиммунных заболеваний легких.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В этой статье описан метод быстрого изоляции первичных мышиных альвеолярных эпителиальных клеток типа II (АЭК II) с использованием отрицательной селекции в потоковом цитометре. Изолированные АЭК II обладают высокой жизнеспособностью и чистотой, что делает их пригодными для различных функциональных и молекулярных исследований, связанных с респираторными заболеваниями.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Физиология дыхания
- Иммунология
Фон
- Альвеолярные эпителиальные клетки типа II играют важную роль в функционировании и гомеостазе легких.
- Понимание их функций важно для изучения респираторных заболеваний.
- Существующие методы изоляции этих клеток могут быть трудоемкими и неэффективными.
- В этом исследовании представлен упрощенный подход для повышения эффективности изоляции.
Цель исследования
- Изоляция чистых и жизнеспособных первичных альвеолярных эпителиальных клеток типа II.
- Содействие последующим функциональным и молекулярным анализам.
- Улучшение понимания роли АЭК II в респираторных заболеваниях.
Используемые методы
- Введение DYS дисплеев и агарозы в легкие и трахею погибших мышей.
- Ручное разрушение легочной ткани после переваривающей обработки.
- Фильтрация полученной суспензии через сита с уменьшающимся размером пор.
- Изоляция АЭК II с помощью отрицательной селекции в потоковом цитометре.
Основные результаты
- Метод обеспечивает высокую жизнеспособность и чистоту изолированных АЭК II.
- Изолированные клетки пригодны для функциональных и молекулярных исследований.
- Процедура эффективна и воспроизводима.
- Потенциальное применение в изучении аутоиммунных и инфекционных респираторных заболеваний.
Выводы
- Этот метод изоляции улучшает исследования альвеолярных эпителиальных клеток типа II.
- Высококачественные АЭК II могут привести к лучшему пониманию респираторных заболеваний.
- Подход может быть применим к другим типам клеток в будущих исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) enables mechanistic de-risking in respiratory disease target validation by providing a disease-relevant system that reflects in vivo complexity. This approach supports predictive confidence in early discovery by yielding highly viable, pure AECII suitable for functional and molecular assays, reducing reliance on immortalized cell lines. The method facilitates translational continuity from discovery through preclinical evaluation of immune-mediated lung pathologies and viral infection models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a primary cell context that retains native lung microenvironmental influences.
- Operational Value: Provides a reproducible source of untouched AECII for pathway clarification and functional target de-risking.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing assessment of compound effects on AECII-mediated immune regulation in infection and autoimmunity models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, highly pure AECII suspensions suitable for downstream functional assays including T-cell stimulation and cytokine profiling.
- Quantitative Output: Enables measurement of dependent variables such as surfactant protein C expression and intracellular viral nucleoprotein levels as biomarkers of cellular state and infection susceptibility.
- Scalability: Compatible with flow cytometry platforms allowing multiplexed sample processing and cross-group comparison in preclinical studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Permits isolation of AECII from mice subjected to respiratory challenges such as influenza infection, enabling study of cell-intrinsic responses under pathophysiological conditions.
- Translational Biomarker Alignment: Facilitates correlation of functional readouts with molecular signatures (e.g., viral protein expression) relevant to human respiratory disease mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing data on AECII viability and susceptibility to viral replication, informing mechanistic de-risking of therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying validated primary AECII for hypothesis testing in early biology, enabling assay development for screening campaigns, and generating quantitative functional and molecular readouts that inform translational research decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in lung immunology by providing access to primary AECII from naïve and challenged mice.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions enabling reproducible compound evaluation in functional assays such as cytokine secretion and immune cell interaction assays.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements including sideward scatter high gating, fluorescence intensity of viral nucleoprotein, and surfactant protein C positivity for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through ex vivo and in vivo infection models that model human respiratory pathogenesis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation workflow applicable across multiple respiratory disease models, reducing redundant optimization efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity through use of primary cells reflecting native lung biology.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via flow cytometric negative selection, minimizing variability introduced by enzymatic depletion or magnetic bead methods.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of lack of efficacy in AECII-mediated pathways, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by generating data on AECII function in infection and autoimmunity, supporting indication selection and biomarker strategy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue handling, enzymatic lung digestion, and flow cytometric cell sorting instrumentation.
- Dependent on access to flow cytometer with appropriate laser and detection capabilities for sideward scatter and fluorescence discrimination.
- Necessitates standardization of antibody cocktails and gating strategies across sites to ensure reproducibility of AECII isolation.
- Involves optimization of tissue disintegration steps to maximize yield while preserving cell viability and surface marker integrity.
- Limited by the accessibility of AECII in diseased lungs, where immune cell infiltration may alter SSChigh gate frequency and require adaptive gating.
