Искусственные антигенпрезентирующей клетки (AAPC) Активация опосредованной и расширение естественных клеток-T убийца

Общая цель данной процедуры заключается в создании искусственных антигенпрезентирующих клеток (A APC) на основе CD 1D для экспансии NKT-клеток. Это достигается путем первоначального добавления белков для функционализации магнитных бусин. На втором этапе проводится обогащение исходной популяции NKT-клеток из периферической крови.

Затем обогащенные T-клетки культивируют совместно с A A PC. На заключительном этапе оценивают фенотип и функцию популяции клеток A A PC. В конечном итоге чистоту экспандированных субпопуляций T-клеток можно определить с помощью проточной цитометрии. Основным преимуществом A APC по сравнению с современными методами, использующими дендритные клетки, является то, что при использовании дендритных клеток может наблюдаться высокая вариабельность между донорами.

Искусственные антигенпрезентирующие клетки (APCs) обеспечивают воспроизводимый, стандартизированный и готовый к использованию метод экспансии NK T-клеток. Идея этого метода возникла у нас, когда я работал с доктором Шнеком и коллегами в Университете Джонса Хопкинса. Они стали первопроходцами в области использования искусственных антигенпрезентирующих комплексов для экспансии классических субпопуляций CD8 T-клеток.

Процедуру продемонстрируют доктор Джеймс Ист, postdoctoral fellow, и доктор Венди, научный сотрудник моей лаборатории. Начните с переноса 1 mL DynaBeads M-450 Epoxy в прозрачную стеклянную виалу из боросиликатного стекла объемом 5 mL с винтовой крышкой. Затем промойте гранулы 3 mL стерильного буфера Borate в отдельной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 mL.

Добавьте 100 µg человеческого CD 1D IG димера и 20 µg необходимых костимулирующих молекул в 1 mL PBS без кальция и магния. Затем поместите стеклянный флакон с бусинами на магнит и аспирируйте боратный буфер. После этого добавьте белковую смесь в стеклянный флакон и закройте его крышкой.

Немедленно перемешайте раствор, перевернув флакон, затем закройте крышку парафильмом и оставьте на ротаторе на ночь при температуре 4 °C. На следующий день снова поместите стеклянный флакон на магнит и аккуратно удалите белковую смесь, стараясь не задеть гранулы. Промойте гранулы трижды, добавив 3 мл буфера для промывки гранул и инкубируя их на ротаторе при температуре 4 °C в течение 5 минут.

Чтобы подтвердить стабильную загрузку белков на гранулы, окрасьте аликвоту гранул антителами и проанализируйте их с помощью проточной цитометрии. Затем перенесите 5 × 10⁷ гранул в небольшой стеклянный флакон объемом 1,5 мл и промойте гранулы 1 мл стерильного PBS. После этого выдержите от 48 до 72 часов перед использованием.

Загрузите промытые гранулы антигеном в одном миллилитре стерильного PBS во время процесса загрузки антигена в гранулы. Соберите PBMC, предварительно разбавив гепаринизированную кровь донора равным объемом PBS при комнатной температуре. Затем добавьте 15 миллилитров PHI комнатной температуры в конические пробирки объемом 50 миллилитров и медленно нанесите 25 миллилитров смеси разведенной крови поверх слоя PHI.

Затем центрифугируйте образцы в течение 30 минут при 700 ×g и комнатной температуре с выключенным торможением. Используя пастерную пипетку, осторожно перенесите интерфейс лимфоцитов в новую коническую пробирку объемом 50 мл. Затем промойте лимфоциты в 50 мл PBS, удалите супернатант и объедините пробирки от одного донора в одну общую пробирку.

После повторного промывания PBMC 20 миллилитрами PBS подсчитайте количество клеток, а затем ресуспендируйте их в max-буфере до концентрации 5 × 10⁷ клеток на миллилитр. Для выделения фракции T-клеток инкубируйте 100 микролитров раствора для обогащения T-клетками PAN из набора для обогащения T-клетками человека EP с двумя миллилитрами PBMC в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем инкубируйте полученный раствор со 100 микролитрами магнитных частиц при комнатной температуре еще в течение 10 минут.

Доведите конечный объем растворителя до 2.5 milliliters, после чего поместите пробирку в магнит. Через пять минут быстро слейте фракцию CD three positive в коническую пробирку объемом 15 milliliter. Теперь промойте клетки в пяти milliliters холодного буфера max и подсчитайте количество жизнеспособных клеток.

Отберите аликвоту для контрольного окрашивания, чтобы сначала отобрать CD 1 61-положительные клетки. Ресуспендируйте обогащенные Т-клетки в 980 microliters ледяного max buffer, затем инкубируйте клетки с 10 micrograms анти-CD 1 61 моноклональных антител в течение 10 минут при температуре four degrees Celsius. После промывки клеток реконструируйте осадок в 800 microliters max buffer и 200 microliters микросфер anti-US IgG one.

Инкубируйте этот раствор при температуре 4 °C еще в течение 10 минут. Пока клетки инкубируются с микросферами, добавьте 3 мл буфера Max для уравновешивания колонки LS. После промывки этой фракции клеток медленно перенесите клетки в 3 мл буфера Max в колонку с помощью пипетки.

Теперь трижды промойте колонку тремя миллилитрами свежего буфера max. Затем добавьте в колонку еще три миллилитра свежего буфера max и перенесите колонку в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Вытолкните очищенные CD161-положительные CD3-положительные клетки, после чего подсчитайте фракцию, обогащенную NKT-клетками.

Начните этот этап с совместного культивирования 10⁶ обогащенных CD161+ CD3+ T-клеток и 10⁶ антигенпрезентирующих клеток (АПК) в 16 мл полной среды. Рапределите по 160 мкл совместной культуры в каждую лунку 96-луночного полистирольного планшета с U-образным дном для культивирования тканей, используя крышку с низкой испаряемостью. На 12-14 день соберите и подсчитайте клетки. Проанализируйте популяции с помощью проточной цитометрии, затем повторите совместное культивирование.

Ранее продемонстрированные экспандированные NKT-клетки можно заморозить после второго раунда экспансии. Чтобы проверить функциональность клеток A A PC, сначала проведите кокультивирование 5 × 10⁴ NKT-клеток на лунку с 5 × 10⁵ A A PC в конечном объеме 200 µL полной среды в 96-луночном U-образном планшете. Через 24–48 часов соберите супернатант клеточной культуры для анализа методом ELISA. На данном рисунке показано, что белки CD 1D IG стабильно иммобилизованы на поверхности магнитных бусин.

Как показано на этом графике, антитела к CD 1D IG и anti CD 28 экспрессированы на поверхности магнитных бусин. Гибридому DN 30 2D three NK T-клеток мыши, положительную по V alpha 14, культивировали совместно либо со средними растворимыми A A PC, не нагруженными антигеном alpha galera, либо с A A PC, нагруженными alpha gal. Затем собирали супернатанты культур и измеряли продукцию IL two методом Eliza, что обеспечивает простой способ тестирования каждой партии антигенпрезентирующих клеток. В данном эксперименте T-клетки периферической крови человека, положительные по CD 1 61 и CD three, были обогащены с помощью сепарации на магнитных бусинах.

Затем клетки стимулировали один раз в неделю в течение 14 дней с помощью A A PC, нагруженных alpha galera, и анализировали экспрессию V alpha 24 и V beta 11. Важно отметить, что даже при относительно низкой начальной популяции NKT-клеток (0,03%) удалось расширить ее примерно до 67% популяции, положительной по V alpha 24 и V beta 11. В данном случае клетки C one R CD 1D инкубировали с NKT-клетками в указанных соотношениях в присутствии или отсутствии антигена Alpha Gal SER в 96-луночных U-образных планшетах в течение 20–24 часов.

Затем с помощью анализа высвобождения хрома оценивали лизис линии клеток B-клеточной лимфомы, опосредованный NKT-клетками. Экспандированные в APC NKT-клетки были способны лизировать данную линию клеток лимфомы. NKT-клетки были экспандированы из PBMC как здоровых добровольцев, так и пациентов с онкологическими заболеваниями, в присутствии или отсутствии альфа-галактозилцерамида (α-galactosylceramide) и нагружены альфа-галактозилцерамидом.

Нам удалось экспансировать популяции NKT-клеток из обеих групп. При использовании исходной популяции из 2 миллионов CD161-положительных CD3-положительных T-клеток после двух раундов экспансии можно получить более 10⁷ клеток. Экспансированные NKT-клетки могут быть использованы для функциональных исследований, как показано в данной работе.

NKT-клетки, экспансированные ex vivo, сохраняют чувствительность к стимуляции Alpha GAL и остаются активными продуцентами IL 17 A, TNF alpha и интерферона гамма. Следует отметить, что если исходная популяция обогащенных T-клеток невелика и невозможно провести второй этап обогащения по CD 1 61, экспансия с помощью A A PC может не дать ожидаемых результатов. Однако, если процент циркулирующих NKT-клеток превышает 0,1%, значительная экспансия инвариантных NKT-клеток все равно должна быть достижима.

В совокупности эти данные демонстрируют, что на основе CD1D созданные А-А-ПК могут эффективно использоваться для экспансии и стимуляции первичных NKT-клеток человека после выполнения данной процедуры. Для ответа на дополнительные вопросы, например, о кинетике активации NKT-клеток после их развития, могут быть применены другие методы, такие как количественная ПЦР (кПЦР). Данная методика открывает исследователям в области гепатологии путь к изучению роли NKT-клеток при жировой болезни печени.