Искусственные антигенпрезентирующей клетки (AAPC) Активация опосредованной и расширение естественных клеток-T убийца

Общая цель данной процедуры заключается в создании искусственных антигенпрезентирующих клеток (A APC) на основе CD 1D для экспансии NKT-клеток. Это достигается путем первоначального добавления белков для функционализации магнитных частиц, после чего следует этап обогащения исходной популяции NKT-клеток из периферической крови.

Затем обогащенные T-клетки культивируют совместно с A A PC. На заключительном этапе оценивают фенотип и функцию популяции клеток A A PC. В конечном итоге чистоту экспандированных подмножеств T-клеток можно определить с помощью проточной цитометрии. Основным преимуществом APC по сравнению с современными методами, в которых используются дендритные клетки, является то, что при использовании дендритных клеток может наблюдаться высокая вариабельность между донорами.

Искусственные антигенпрезентирующие клетки (APCs) обеспечивают воспроизводимый, стандартный и готовый к использованию метод экспансии NK T-клеток. Идея этого метода возникла у нас, когда я работал с доктором Шнеком и Оки в Университете Джонса Хопкинса. Они стали первопроходцами в области использования искусственных антигенпрезентирующих комплексов для экспансии классических субпопуляций CD8 T-клеток.

Процедуру продемонстрируют доктор Джеймс Ист, постдок, и сын доктора Венди, научный сотрудник моей лаборатории. Начните с переноса 1 mL эпоксидных бусин DynaBead M-450 в прозрачный винтовой флакон из боросиликатного стекла объемом 5 mL. Затем промойте бусины 3 mL стерильного буфера Borate в отдельной микроцентрифужной пробирке объемом 1.5 mL.

Добавьте 100 µg человеческого димера CD 1D IG и 20 µg соответствующих костимулирующих молекул в 1 мл PBS без кальция и магния. Затем поместите стеклянный флакон с гранулами на магнит и аспирируйте боратный буфер. После этого добавьте белковую смесь в стеклянный флакон и закройте его крышкой.

Сразу же перемешайте раствор, перевернув флакон, затем закройте крышку парафильмом и оставьте на ротаторе на ночь при температуре 4 °C. На следующий день снова поместите стеклянный флакон на магнит и аккуратно удалите белковую смесь, стараясь не задеть гранулы. Промойте гранулы трижды, добавив 3 мл буфера для промывки гранул и инкубируя их на ротаторе при температуре 4 °C в течение 5 минут.

Чтобы подтвердить стабильность связывания белков с бусинами, окрасьте аликвоту бусин антителами и проанализируйте их с помощью проточной цитометрии. Затем перенесите 5 × 10⁷ бусин в небольшой стеклянный флакон объемом 1,5 мл и промойте бусины 1 мл стерильного PBS. После этого выдержите от 48 до 72 часов перед использованием.

Во время насыщения бусин антигеном перенесите промытые бусины с антигеном в один миллилитр стерильного PBS. Соберите PBMC, предварительно разбавив гепаринизированную кровь донора равным объемом PBS при комнатной температуре. Затем добавьте 15 миллилитров PHI комнатной температуры в конические пробирки объемом 50 миллилитров и медленно наслоите 25 миллилитров разбавленной смеси крови поверх PHI.

Затем центрифугируйте образцы в течение 30 минут при 700 ×g и комнатной температуре с выключенным тормозом. Используя пастеровскую пипетку, осторожно перенесите интерфазу лимфоцитов в новую коническую пробирку объемом 50 мл. Затем промойте лимфоциты в 50 мл PBS, удалите супернатант и объедините содержимое пробирок от одного донора в одну общую пробирку.

После повторного промывания PBMC 20 миллилитрами PBS подсчитайте количество клеток, а затем resuspended их в max-буфере до концентрации 5 × 10⁷ клеток на миллилитр. Чтобы выделить фракцию T-клеток, инкубируйте 100 микролитров раствора для обогащения PAN T-клеток из набора для обогащения T-клеток человека EP с двумя миллилитрами PBMC в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем инкубируйте полученный раствор со 100 микролитрами магнитных бусин при комнатной температуре еще в течение 10 минут.

Доведите конечный объем растворителя до 2.5 milliliters, после чего поместите пробирку в магнит. Через пять минут быстро слейте фракцию CD three positive в коническую пробирку объемом 15 milliliters. Затем промойте клетки в пяти milliliters холодного буфера max и подсчитайте количество жизнеспособных клеток.

Отберите аликвоту для контрольного окрашивания, чтобы сначала выделить CD 1 61-положительные клетки. Ресуспендируйте обогащенные T-клетки в 980 µL ледяного буфера Max, затем инкубируйте клетки с 10 µg моноклональных антител к CD 1 61 в течение 10 минут при температуре 4 °C. После промывки клеток реконструируйте осадок в 800 µL буфера Max и 200 µL микросфер anti-US IgG 1.

Инкубируйте этот раствор при температуре 4 °C еще в течение 10 минут. Пока клетки инкубируются с микросферами, добавьте 3 мл буфера Max для уравновешивания колонки LS. После промывки этой фракции клеток медленно перенесите пипеткой клетки в 3 мл буфера Max в колонку.

Теперь промойте колонку три раза тремя миллилитрами свежего буфера max. Затем добавьте в колонку еще три миллилитра свежего буфера max и перенесите колонку в коническую пробирку объемом 15 мл. Вытесните очищенные клетки CD161+ CD3+ и затем подсчитайте фракцию, обогащенную NKT-клетками.

Начните этот этап с совместного культивирования 10⁶ обогащенных CD61-положительных CD3-положительных Т-клеток и 10⁶ антигенпрезентирующих клеток (АПК) в 16 мл полной среды в планшете. Перенесите по 160 мкл совместной культуры в каждую лунку 96-луночного планшета с U-образным дном из полистирола, обработанного для культивирования тканей, с крышкой с низкой испаряемостью. На 12–14 день соберите и подсчитайте клетки. Проанализируйте популяции с помощью проточной цитометрии, затем повторите совместное культивирование.

После завершения второго раунда экспансии избыточные экспансированные NKT-клетки следует заморозить, как было показано ранее. Для проверки функциональности клеток A A PC сначала проведите совместное культивирование: поместите 5 × 10⁴ NKT-клеток и 5 × 10⁵ A A PC в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета в конечном объеме 200 µL полной среды. Через 24–48 часов соберите супернатант клеточной культуры для анализа методом ELISA. На этом рисунке показано, что белки CD 1D IG стабильно иммобилизованы на поверхности магнитных частиц.

Как показано на этом графике, антитела к CD 1D IG и CD 28 экспрессируются на поверхности магнитных бусин. Гибридому DN 30 2D three NK T-клеток мыши, позитивную по V alpha 14, культивировали совместно либо с растворимыми в среде A A PC, не нагруженными alpha-галактера-антигеном, либо с A A PC, нагруженными alpha-галактозой. Затем собирали супернатанты культур и измеряли продукцию IL two методом Eliza, что представляет собой простой способ тестирования каждой партии антигенпрезентирующих клеток. В данном эксперименте Т-клетки периферической крови человека, позитивные по CD 1 61 и CD three, были обогащены с помощью сепарации на магнитных бусинах.

Затем клетки стимулировали один раз в неделю в течение 14 дней с помощью A A PC, нагруженного alpha galera, и анализировали экспрессию V alpha 24 и V beta 11. Важно отметить, что было обнаружено, что даже при относительно низкой начальной популяции NKT-клеток (0,03%) клетки смогли расшириться до популяции, в которой около 67% были положительны по V alpha 24 и V beta 11. Здесь клетки C one R CD 1D инкубировали с NKT-клетками в указанных соотношениях в присутствии или отсутствие антигена Alpha Gal SER в 96-луночных U-образных планшетах в течение 20–24 часов.

Затем была проведена оценка цитолиза линии B-клеточной лимфомы, опосредованного NKT-клетками, с помощью анализа высвобождения хрома. NKT-клетки, экспандированные в условиях PC, были способны лизировать данную линию клеток лимфомы. NKT-клетки были экспандированы из PBMC как здоровых добровольцев, так и пациентов с онкологическими заболеваниями, в присутствии или отсутствии альфа-галера, и нагружены альфа-галерой.

С помощью ПК удалось расширить популяции NKT-клеток обеих групп. При использовании исходной популяции из 2 миллионов CD161-положительных CD3-положительных T-клеток после двух раундов экспансии можно получить более 10⁷ клеток. Экспансированные NKT-клетки могут быть использованы для функциональных исследований, как продемонстрировано здесь.

NKT-клетки, экспандированные ex vivo, сохраняют чувствительность к стимуляции Alpha GAL и остаются активными продуцентами IL 17 A, TNF alpha и интерферона гамма. Следует отметить, что если начальная популяция обогащенных T-клеток невелика и второй этап обогащения по CD 1 61 не может быть выполнен, экспансия с помощью A A PC может не дать ожидаемых результатов. Однако, если процент циркулирующих NKT-клеток превышает 0,1%, все равно должна быть возможна значительная экспансия инвариантных NKT-клеток.

В совокупности эти данные демонстрируют, что антигенпрезентирующие клетки (APC) на основе CD1D могут эффективно использоваться для экспансии и стимуляции первичных NKT-клеток человека после проведения данной процедуры. Для ответа на дополнительные вопросы, такие как кинетика активации NKT-клеток после их развития, могут быть применены другие методы, например, кПЦР. Данная методика открывает исследователям в области гепатологии путь к изучению роли NKT-клеток при жировой болезни печени.