Ассоциативный аппетит обонятельного обучения в Drosophila Личинки

Целью данной процедуры является анализ высших функций головного мозга на простой модели — личинок DFA, используя аппетит и ассоциативное обонятельное обучение. Для этого сначала из флакона с кормом собирают 30 сытых личинок третьей стадии развития.

Затем личинок в течение пяти минут обучают в чашке Петри, используя фруктозу в качестве подкрепления и контейнеры с запахом с каждой стороны, содержащие один октанол в качестве ольфакторного стимула. После этого проводится второй этап обучения продолжительностью пять минут в чашке без фруктозного подкрепления и с контейнерами с запахом с каждой стороны, содержащими ацетат амала. После трех повторений этих двух этапов обучения личинок в течение пяти минут подвергают тесту без подкрепления, помещая их между контейнерами с запахами на противоположных сторонах.

В конечном итоге, относительное предпочтение одного запаха по сравнению с ацетатом амала указывает на то, что личинки дрозофилы способны формировать ассоциацию между ольфакторными стимулами и сахарным вознаграждением, что позволяет изучать ассоциативное обучение в генетически пластичной системе. Данный метод в сочетании с генетическим вмешательством в нейронную функцию может помочь ответить на ключевые вопросы в области обучения и памяти, такие как: какие нейроны сигнализируют о вознаграждении, или какие нейроны необходимы или достаточны для формирования или извлечения повторяющейся памяти? Демонстрация процедуры будет представлена в послеоперационном периоде.

Аспирант из моей лаборатории сначала готовит чашки Петри с 2,5% aros без фруктозы. Для приготовления чашек с фруктозой добавьте фруктозу в растворенный aros, а затем разлейте его по чашкам. Затем пометьте каждую из этих чашек разным символом, чтобы обеспечить слепой метод проведения эксперимента.

Чашка, содержащая фруктозу, служит подкрепляющим вознаграждением, а пустая чашка — контролем без вознаграждения. В качестве условных стимулов подготовьте три специально изготовленных тефлоновых контейнера для запахов, в каждый из которых внесите 10 µL чистого октанола-1. В крышках контейнеров имеются небольшие отверстия для испарения вещества.

Во-вторых, подготовьте еще три контейнера с запахом, содержащих 10 µL амилацетата, разведенного в парафиновом масле в соотношении 1:50. Такой разведение так же привлекательно, как и 10 µL чистого октанола; начните со сбора 30 особей, которые питаются, а не блуждают. В-третьих, из флакона с пищей.

Данный протокол можно выполнять в любое время суток, так как он не зависит от циркадных ритмов. Перенесите личинок в чашку Петри с несколькими каплями водопроводной воды и осторожно перемещайте их вперед и назад с помощью кисточки.

Затем перенесите личинок во вторую чашку Петри, в которой также находится несколько капель водопроводной воды. Проверьте, нет ли на теле личинок остатков пищевой пасты. Теперь поместите чашку Петри в экспериментальную установку, чтобы приучить личинок ассоциировать запахи с определенным сахарным сигналом.

Поместите контейнеры с запахом по левую и правую стороны одной из двух чашек, используемых в качестве стимулов. В данном случае используется одна чашка, однако выбор произволен, так как экспериментатор не знает, где находится награда. Затем поместите группу личинок в центр чашки.

Закройте крышку и подождите пять минут, пока животные подвергаются воздействию стимулов. Убедитесь, что личинки могут преодолеть поверхностное натяжение капли воды, чтобы они не оказались в ловушке и могли свободно перемещаться. Поместите новый контейнер с ацетатом амала на чистую чашку Петри.

Через пять минут с помощью увлажненной кисточки перенесите личинок в чашку с противоположным типом стимулов, расположенных слева и справа. В данном случае в качестве запаха используется амаль acetate. После переноса личинок закройте крышку и дайте животным возможность исследовать среду в течение пяти минут.

По истечении этого времени первый раунд обучения считается завершенным. Проведите еще два раунда обучения таким же образом, как и первый. Перемещайте животных с помощью влажной кисточки, предъявляя каждую комбинацию стимула и вознаграждения в общей сложности три раза.

Для проведения экспериментального теста поместите контейнеры со свежими запахами (по одному для каждого стимула) на противоположные стороны чашки Петри из неглазурованного агара. Перенесите обученных животных в центр чашки. Закройте крышку и подождите пять минут.

Спустя пять минут подложите под чашку шаблон, четко разделяющий ее на три зоны: левую, правую и центральную, и подсчитайте количество личинок в каждой зоне. Нахождение личинок в центральной зоне расценивается как отсутствие предпочтения, что делает анализ более строгим и менее подверженным систематической ошибке. Наконец, для завершения эксперимента отберите 30 новых личинок третьего возраста, находящихся на голодном режиме, и повторите обучение и тестирование с противоположной комбинацией поощрения и стимулов.

Продолжайте использовать те же контейнеры с запахами. Для определения того, сохраняется ли у трансгенных животных нормальная обработка запахов в ответ на стимулирующие вознаграждение раздражители, необходимо провести несколько контрольных тестов. Тест на предпочтение запахов у наивных особей начинается со сбора и промывки 30 личинок, как это делалось при обучении и тестировании.

Затем перенесите личинок в чашку Петри с агар-агаром, в которой с одной стороны находится один флакон со стимулом. Закройте крышку и подождите пять минут. После этого, используя шаблон, подсчитайте количество личинок на ближней стороне, в центре и на дальней стороне чашки относительно стимула.

Проведите данный тест для каждого стимула, используемого в эксперименте, чтобы определить предпочтение сахаров у наивных особей. Подготовьте чашки Петри с разделением 50/50, вырезав половину агарозы в стандартной чашке и заполнив свободное пространство расплавленной агарозой другого типа. Следите за тем, чтобы объемы обеих половин совпадали и между ними не образовалось четкой границы.

Это может потребовать практики с использованием подготовленной чашки Петри, находящейся при комнатной температуре; поместите в нее 30 наивных, очищенных от корма особей. Поместите личинок в центр чашки. Закройте крышку и подождите пять минут.

Затем с помощью шаблона подсчитайте количество личинок по обеим сторонам, а также количество личинок в центре. Описанная процедура использовалась для обучения и тестирования тренчгенных личинок. С использованием примеров стимулов данные подсчитывались как количество личинок в различных областях чашек Петри.

По истечении пяти минут после этого этапа предпочтения данных были рассчитаны, и на основе групп с взаимным обучением были выведены показатели эффективности. Поскольку тестируемые личинки были трансгенными, им также предлагали выбор между заполненным контейнером с запахом и воздухом, а также выбор между чистым ароматом и ароматом с добавлением сахара. Анализ рассчитанных показателей с помощью диаграммы размаха показал, что животные смогли научиться различать один октанол от ML-ацетата, используя фруктозные ароматы в качестве аппетитного подкрепления.

Животные распознали оба стимула как аттрактанты и проявили первичную склонность к запаху фруктозы по сравнению с запахом воздуха. Данная экспериментальная парадигма успешно применялась с широким спектром ольфакторных и зрительных стимулов, а также с разнообразными поощряющими и карающими стимулами. Эта парадигма в сочетании с многочисленными эффективными методами генетических манипуляций, доступными для Drosophila, особенно полезна при анализе нейронных сетей; например, путем генетического воздействия на определенные группы нейронов, определяемые паттернами экспрессии gal4, можно оценить функциональную роль этих нейронов в обучении аппетиту.

Данную процедуру в сочетании с генетическим воздействием на функции нейронов можно использовать для анализа нейронных сетей мозга личинки, участвующих в процессах обучения и памяти. Благодаря простоте строения мозга личинки такой анализ может быть проведен вплоть до уровня отдельных клеток.