Определение летучих Обонятельные с помощью газовой хроматографии-Multi-единицы Recordings (ГКХ) в усиков насекомого Lobe

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы идентифицировать биологически эффективные пахучие вещества в сложном смысле этого слова с помощью записей в мозге шмеля. Это достигается, во-первых, путем сбора чувствительных поведенческих эффектов, а во-вторых, подготовки газового хроматографа и многоканальных систем записи к эксперименту. Третий шаг заключается в подготовке и препарировании мозга шмеля для нейронных записей в антенне заводской лепестки.

Затем эксперимент проводится путем вставки электродов в лепесток антенны и измерения реакции на затяжные летучие вещества путем анализа нейронной активности в ответ на сложные органы чувств и их индивидуальные составляющие. Можно идентифицировать биологически активные одоранты, полученные с помощью газовой хроматографии. Таким образом, основным преимуществом этого метода по сравнению с другими методами, такими как G-C-E-A-G, является чувствительность нейронов антенной нагрузки и возможность охарактеризовать, как нейроны в мозге реагируют на определенные цветочные летучие вещества.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как комбинированные этапы электрофизиологического и химического анализа трудно освоить из-за техники регистрации электрофизиологического препарата и необходимых этапов для сбора летучих веществ в свободном пространстве. Хотя этот метод может дать представление о обонятельной обработке шмелей, он также может быть применен к другим системам, таким как факторы болезней, такие как комары или целующиеся клопы, или вредители сельскохозяйственных культур, такие как тля или моль. Для этой процедуры подготовлен электрод сравнения из вольфрамовой проволоки на микроманипуляторе на секунду.

Микроманипуляторы имеют многоканальный электрод, такой как спиральный провод, теде или кремниевый многоканальный электрод, подключенный к предусилителю, имеют газовый хроматограф с выходом на экранированный БНК-стол. Выход детектора ГХ сопряжен с усилителем и системой сбора данных таким образом, что нейронный и ГХ-сигналы синхронизированы. В этом примере газом-носителем ГХ является гелий, который находится в колонне DB с пятью ГХ.

В GC используется входное отверстие с разделенным списком с температурой, установленной на 200 градусов Цельсия, и температурой детектора ионизации пламени, установленной на 230 градусов Цельсия. После нагрева образцов в GC сток из колонки разделяется один к одному между пламенно-ионизационным детектором и антенной B с помощью стеклянного y-образного разъема. В этом примере ГХ используется для доставки летучих веществ, собранных путем динамического поглощения из цветков мимуса Льюиса, альпийского полевого цветка, произрастающего в Калифорнии.

В качестве альтернативы, вместо использования гх, одиночные летучие соединения или смеси соединений могут подаваться с помощью воздушных импульсов. Выстреливается через отдельный стеклянный шприц, содержащий лист фильтровальной бумаги, на который были нанесены соединения. Воздушные импульсы отклоняются от постоянного воздушного потока с помощью электромагнитного клапана, управляемого компьютером.

Начните подготовку, отрезав примерно в одном сантиметре от конца кончика пипетки объемом в один миллилитр. Поместите шмеля в основание наконечника пипетки и осторожно надавите на него к противоположному концу наконечника, пока не обнажится только головка. С помощью расплавленного стоматологического воска сделайте слепок вокруг обнаженной головки.

Воск должен прилипнуть к составным глазам, чтобы полностью обездвижить голову, но при необходимости он не должен контактировать с антенной. Используйте небольшие штифты для обездвиживания усиков. Затем сделайте квадратное окошко, похожее на надрез в капсуле головы, с помощью острого лезвия, такого как микроскальпель.

Начните резку непосредственно за антенной и рядом с одним из сложных глазков. Проведите прямую линию между глазами. Далее режьте дорсально до тех пор, пока головная капсула не изгибается к грудной клетке.

Продолжайте срез до противоположного конца головной капсулы. Наконец, вернитесь к началу, чтобы завершить квадрат. Используйте щипцы для удаления кутикулы.

Кутикула, прилегающая к антенне, должна быть удалена, иначе она будет препятствовать электроду, как только мозг будет обнажен. Сразу же супер сплавляйте ткань с солевым раствором насекомых. Убедитесь, что лепестки антенны хорошо открыты.

Затем осторожно с помощью пары очень тонких щипцов удалите периневральную оболочку непосредственно над лепестками антенны. Будьте очень осторожны, чтобы не проколоть мозг пчелы щипцами. Теперь пчелиный препарат готов к электрофизиологической регистрации.

Начните с того, что прикрепите подготовленную пчелу к зажиму, который закреплен на магнитном основании. Держите его супер сросшимся с солевым раствором насекомых, подаваемым из резервуара с помощью регулятора потока. Теперь вставьте электрод сравнения в контралатеральную ткань мозга.

Далее вставьте многоканальный электрод в лепестки антенны пчелы. Когда электроды на месте. Подождите от 30 до 60 минут, чтобы запись стабилизировалась.

В течение этого времени подготовьтесь к внеклеточным всплескам от нейронов, также устанавливая пороговые значения. Отдельные каналы записи Для некоторых каналов может потребоваться ручное определение пороговых значений из-за шума в каналах записи. Затем убедитесь в правильности температурного нарастания прогона GC.

В этом примере температура начинается с 50 градусов Цельсия в течение четырех минут, а затем увеличивается на 10 градусов в минуту до конечной температуры 220 градусов Цельсия, или она держится в течение шести минут. Когда формы волн единиц в каналах записи становятся одинаковыми, нейронные записи считаются стабильными. После стабилизации загрузите в шприц цветочный запах и введите запах в отверстие для инъекций головки GC.

Затем немедленно начните запись с электродов после завершения прогона ГХ. Дайте приготовлению отдохнуть от пяти до 15 минут. Затем либо вводят другой образец в ГХ, либо стимулируют препарат с помощью отдельных летучих соединений или смесей соединений.

Если в какой-то момент спонтанная активность внезапно прекращается или меняется, проверьте капельницу с физраствором и дайте препарату отдохнуть в течение 15 минут. Затем, если активность не восстанавливается на прежнем уровне, откажитесь от подготовки. После эксперимента зафиксируйте мозг с помощью зондов, все еще находящихся в тканях, затем иссеките мозг, очистите фиксирующий фактор и обезвожьте мозг.

Расположение записывающих каналов затем может быть определено с помощью конфокальной микроскопии по цветочному аромату mimus Luci. Общее количество нестабильных предметов, через которые проходит мародерство. ГК обычно составляет от 60 до 70 соединений.

Аромат Mimus Luci преимущественно состоит из монотерпеноидов, в том числе бета-миозина и альфа-пинина. Остальная часть аромата состоит из шести углеродных летучих веществ. Несколько препаратов стимулировали тремя микролитрами экстракта глаз Мимуса Льюиса.

Эта запись с одной из восьми нейронных единиц, записанных многоканальным электродом, показывает, насколько селективно нейрон конкурирует с определенными летучими веществами. В данном примере dine — это показанное соединение. Вот ответы восьми нейронных единиц.

Около половины ансамбля не реагировали. Это удивительно, учитывая разнообразие летучих соединений, о которых говорится в цветочном пространстве, но это согласуется между препаратами и сообщается в других исследованиях. Нормированная скорость срабатывания чувствительных единиц показывает, что существует сильная селективность по группе одорантов.

Запахи, выделенные стрелками, вызвали наиболее устойчивую реакцию. Это демин и транс бета осаин. Так что после просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как подготовить свое насекомое к эксперименту и затем провести эксперимент с помощью газовой хроматографии с многоканальной записью.

Цель состоит в том, чтобы идентифицировать предполагаемые поведенчески эффективные ароматанты в сложном букете. После освоения этой техники ее можно выполнить за два-три часа, если она выполнена правильно после этой процедуры. Другие методы, такие как поведенческое тестирование с идентифицированными одорантами, могут быть выполнены для того, чтобы полностью определить эффективность летучих веществ в посредничестве поведенческой реакции насекомого.