Высокое содержание изображений Workflow по изучению Grb2 сигнализации комплексы выражением Клонирование

Общей целью данного эксперимента является идентификация партнеров по взаимодействию Grab 2 с помощью клонирования экспрессии CD NA и наблюдения за изменениями в зеленом флуоресцентном белке, помеченном Grab two. Это достигается путем предварительного приготовления библиотеки CD NA из бактериальных лизатов в качестве второго этапа. КДНК трансфицируются в эмбриональные клетки почек человека, что приводит к экспрессии репортерной конструкции вместе с генами, представляющими интерес

Затем трансфицированные пластины анализируют на оперном микроскопе с целью визуализации изменений в локализации grab two по всем клеткам, получают результаты, которые показывают опосредованное рецептором эпидермального фактора роста рекрутирование меченного GFP. Возьмите два эндосомы на основе флуоресцентной микроскопии. Основное преимущество этой методики по сравнению с существующими методами, такими как эти два гибрида, заключается в том, что партнеры по взаимодействию могут быть идентифицированы в физиологической ситуации, которая учитывает субклеточное распределение партнеров по взаимодействию.

Что ж, этот метод может быть использован для идентификации передачи сигнала по Grab two. Он также может быть применен к другим системам, таким как другие белки, представляющие интерес. Библиотека CDNA содержит отдельные клоны бактерий в глицериновых запасах.

В формате 96 лунок с помощью команды reray в меню выбора пикера пикера Hudson Rapid. Соберите клоны бактерий с исходной пластины и введите их в 1,5 миллилитра фунта ампера в луночном планшете глубиной 96 лунок. Позднее запечатайте пластины глубоких лунок газопроницаемым уплотнением и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в вибростенде На следующий день вращайте глубинные луночные пластины, содержащие бактерии A 2000 об/мин, в течение 20 минут.

Используя пластинчатые адаптеры в настольной центрифуге, отсасывайте среду из лунок, оставляя бактериальную гранулу нетронутой. Затем настройте деку рабочей станции Tecan Freedom Evo Automation, как показано ниже. Распределите растворы для приготовления плазмид по одному или пяти желобам и поместите на деку глубокую луночную пластину.

Поместите многолуночное желоб с алюцианским раствором рядом с наконечниками для загрузки глубинных скважин в наконечники для наконечников. Соберите вакуумный коллектор. Плазмидная связующая пластина помещается внутрь коллектора, а плазмидная фильтрующая пластина размещается поверх суспензионных гранул коллектора Resus с 250 микролитрами одного раствора.

Буфер суспензии Resus путем пипетирования вверх и вниз. Обеспечение полного ресуспендирования гранул имеет решающее значение для успеха этой процедуры. Шейкер можно использовать, если поглаживание вверх и вниз не приводит к полной суспензии гранулы.

После того, как гранулы полностью ресуспендированы, бактерии откладываются путем добавления 250 микролитров раствора в буфер для лизиса. Закройте пластину и переверните, чтобы обеспечить полное перемешивание. Установите таймер на две минуты.

Далее добавляем 350 микролитров раствора три. Буфер нейтрализации. Запечатайте пластину и переверните три раза линии.

Перенесите бактериальные лизаты на плазмидные фильтрующие пластины. Примените вакуум на пять минут. Снимите фильтрующую пластину и поместите связующую пластину на верхнюю часть коллектора.

Примените вакуум на одну минуту. Добавьте 500 микролитров дополнительного буфера для стирки и примените пылесос на две минуты. Добавьте 900 микролитров буферного раствора для стирки четыре и примените вакуум на две минуты.

После этого добавьте 900 микролитров промывочного буферного раствора еще четыре раза и примените вакуум на 15 минут. Поместите пластину для сбора ДНК внутрь коллектора. Добавьте в связующую пластину 100 микролитров элуцианского буфера и выдерживайте в течение двух минут.

Примените вакуум на 10 минут. Наконец, снимите планшет для сбора и измерьте концентрацию ДНК с помощью NanoDrop 8,000. Как правило, при этом методе можно ожидать выхода около 100 нанограммов на микролитр для начала этой процедуры.

После гек 2 9 3 клетки трипсы, инизируются и подсчитываются. Используйте автоматический дозатор для дозирования два раза по 10 на четыре ячейки в каждую лунку Perkin Elmer. Планшет для просмотра инкубирует клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа для трансфекции.

С помощью автоматизированного манипулятора жидкостей приготовьте следующую смесь в каждой лунке круглого дна 96, луночной пластины 100 нанограмм GFP. Возьмите две плазмидные ДНК со 100 нанограммами CD NA в 25 микролитрах свободной сыворотки среды. Далее добавьте 25 микролитров сыворотки свободной среды, содержащей 0,5 микролитра перемешанной в лунку и запустите таймер на 30 минут.

Через 30 минут перенесите 50 микролитров на трансфект CDNA в смеси в клетки. Использование щадящего метода дозирования. Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе.

Чтобы начать получение изображения, запустите программу Opera. Выберите вкладку «Конфигурация» и выберите цель в 20 раз и правильный тип пластины. Убедитесь, что воротник установлен на правильное значение на объективе, чтобы можно было фокусироваться с различными типами пластин.

Затем выберите вкладку микроскопа. Определите первую экспозицию как лазер fite 4 88, а вторую экспозицию как лазер UV 365. Активируйте УФ-фильтр для обеих экспозиций и назначьте экспозицию.

Один на камеру один и экспозиция. Два на камеру два. Установите время экспозиции на 800 миллисекунд для экспозиции, одну и 40 миллисекунд для экспозиции.

Два, выбираем экспозицию, один устанавливаем высоту фокусировки на ноль мкм. Выберите фокус после фокусировки. Выставьте камеру один.

Отрегулируйте высоту фокусировки для оптимизации плоскости экспозиции и нажмите на высоту захвата. Сохраняем параметры экспозиции, повторяем для экспозиции. Во-вторых, выберите вкладку определения эксперимента, создайте макет и вложенный макет.

Перетащите соответствующий макет, экспозицию, эталонное изображение, наклон, файл обрезки и подмакет. Сохраните эксперимент. Выберите вкладку «Автоматический эксперимент» и получайте изображения в нормальных условиях.

Захват номер два локализуется по всей ячейке. При стимуляции рецептора фактора роста он перемещается на плазматическую мембрану и впоследствии интернализуется в эндосомы. На этом рисунке на верхней панели показаны шесть клеток CO M, которые были временно трансфицированы GFP grab two, и, как и ожидалось, флуоресценция распределена по всей клетке.

Однако в клетках, временно трансфицированных GFP grab two плюс рецептор клеточной поверхности IT EGFR grab two перемещается в эндосомоподобные структуры, как показано на нижней панели. Таким образом, при применении полногеномной библиотеки можно ожидать, что могут быть идентифицированы новые два связывающих белка клеточной поверхности. Этот метод не ограничивается обнаружением белков клеточной поверхности.

Например, DYNAMIN 2 GPA, который участвует в эндоцитозе, опосредованном вторым захватом, индуцирует транслокацию второго захвата. В этом эксперименте GFP grab two был трансфицирован DNM 2 в HEC 2 93 Т-клетки. Перемещение второго захвата GFP в эндосомоподобные структуры иллюстрируется клетками внутри красных кругов.

После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как иммунопреципитация или биохимический анализ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как является ли взаимодействие прямым или косвенным. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать клонирование экспрессии для выявления субклеточных белковых взаимодействий.