Выделение лимфоцитов из половых путей мышь Mucosa

Эффективный способ изолировать тракта лимфоциты мыши половых описано. Этот метод использует фермент переваривания и Percoll разделения градиента, чтобы обеспечить эффективное изоляции. Эта методика также адаптируется к для использования в других видах

Общая цель этой процедуры заключается в выделении лимфоцитов из репродуктивного тракта мыши. Это достигается путем удаления всего полового тракта и измельчения ткани на мелкие кусочки, чтобы освободить лимфоциты от ткани. Мелко измельченная ткань переваривается с помощью коллагеназы и энергичного перемешивания ткани при 37 градусах Цельсия.

С помощью магнитного перемешивания лимфоциты затем изолируются с помощью градиента для каждого звонка. В конечном счете, лимфоциты могут быть охарактеризованы с помощью проточной цитометрии, что распространяется на диагностику и терапию репродуктивных заболеваний. Так как этот метод позволяет понять поведение тканевых лимфоцитов, которые часто отличаются от лимфоцитов, выделенных из циркулирующей системы.

Хотя этот метод дает представление о системе слизистой оболочки репродуктивной системы, он также может применяться к другим системам, таким как системы слизистой оболочки кишечника и дыхательных путей. После усыпления самки мыши с помощью хирургических ножниц сделайте низкий разрез по средней линии, а затем откройте кожу. Осторожно отодвиньте кишечник в сторону, определите ucs, а затем изолируйте и удалите весь половой путь от ucs до открытого влагалища.

Поместите половые пути в чашку Петри. С помощью ножниц раскройте весь тракт в продольном направлении. Затем перенесите ткань в чашку Петри с полным фильтром RPMI 10.

Теперь разрежьте половые пути на мелкие кусочки, а затем переложите кусочки в колбу, содержащую полный RPMI 10 и ЭДТА. Поместите колбу на магнитную мешалку и каждый раз перемешивайте ткань два раза в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы избавиться от эпителиальных клеток после последнего периода перемешивания, выбросьте надосадочную жидкость, а затем вылейте кусочки ткани через клеточное сетчатое фильтр 40 микрометров в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Смойте остатки ЭДТА полным фильтрующим материалом.

Теперь переложите отфильтрованные кусочки ткани в новую колбу со свежим RPMI 10 и коллагеназой и переварите кусочки при температуре 37 градусов Цельсия на магнитной мешалке, настроенной на энергичное перемешивание ткани через час, вылейте надосадочную жидкость через клеточное сетчатое фильтр 100 микрометров в свежую коническую пробирку объемом 50 миллилитров и держите отфильтрованную клеточную суспензию на льду. Добавьте свежий RPMI 10 с коллагеназой в исходную колбу и перемешайте ткань еще два раза, используя каждый раз свежий полный RPMI 10 и коллагеназу. После третьего вываривания в растворе не должно присутствовать видимых кусочков ткани.

Теперь объедините надосадочную жидкость из трех пищеваренных процессов. Вращайте клетки в течение пяти минут при температуре 410 G и четырех градусах Цельсия, а затем выбросьте надосадочную жидкость. Начните с реактивной суспензии клеточной гранулы в свежем растворе 40% на вызов.

Добавьте клеточную суспензию с 40%за звонок в градиентную трубку, а затем тщательно подложите и сравняйте объем свежеприготовленной. 70%за звонок. Теперь центрифугируйте градиентные образцы в течение 20 минут при комнатной температуре с отрывом.

После центрифугирования тщательно собирают лимфоциты в приграничном слое между перол-градиентами. Затем промойте восстановленные клетки с помощью RPMI один-три в течение 10 минут при комнатной температуре. Наконец, после отбрасывания супнатанта повторно суспендируют лимфоциты в соответствующем растворе в соответствии с желаемой экспериментальной процедурой.

Эта точечная диаграмма является примером популяции лимфоцитов, которая была выделена из половых путей мыши, инфицированной хламидией уредерми, интравагинально инфицированной. Через семь дней после инфицирования суспензию одиночных клеток затравливали на CD три положительных лимфоцита и анализировали на CD 4 и CD 8 экспрессирующих клеток после ее развития. Этот метод проложил путь исследователю к изучению функции репродуктивных лимфоцитов и характеристик клеток в модели вирусных заболеваний мышей, которые имитируют болезни человека.