Хромосома Репликация времени в сочетании с Флуоресцентные В месте Гибридизация

Этот экспериментальный подход сочетает в себе инкорпорирование BRDU с флуоресцентной гибридизацией в C-2. Провести количественный анализ времени репликации хромосом млекопитающих. Во-первых, включите BRDU в живые клетки и соберите метафазные хромосомы.

Затем выполните исследование ДНК рыб в сочетании с последовательным окрашиванием антител BRDU для идентификации отдельных реплицирующихся хромосом. Затем используйте фотомикроскопию для получения изображений сигналов рыб и включения BRDU в отдельные митотические фигуры. Используя программное обеспечение для зрения Cyto, рассчитайте площадь и интенсивность пикселей, представленных сигналами BRDU или DPI на каждой изолированной хромосоме.

Результаты могут количественно оценить и сравнить включение BRDU в отдельные перестроенные хромосомы и их голосомы. Поскольку описанный здесь метод оценивает отдельные клетки, он обладает способностью обнаруживать изменения в репликации, синхронизации хромосомных перестроек, которые присутствуют только в части клеток в популяции, по сравнению с недавно разработанными высокопроизводительными микрочипами и протоколами секвенирования ДНК. Этот метод позволяет проводить прямое сравнение гомологичных хромосом, находящихся в пределах одной клетки.

Он также обладает способностью однозначно выявлять хромосомные перестройки, которые влияют на репликацию хромосом. Хронометраж целых хромосом, демонстрирующих процедуру, будет Лесли Смит. Научный сотрудник в моей лаборатории засеял клетки примерно на 70% в 150-миллиметровой чашке для культуры тканей и поместил в клеточный инкубатор на 24 часа в нужное время.

Баллы перед сбором урожая. Пополняйте среду свежей полноценной средой, содержащей 10 микрограмм на миллилитр. БРДУ. Продолжительность культивирования клеток в среде с BRDU будет варьироваться в зависимости от типа и вида клеток.

Как правило, G 2 фаза составляет от двух до пяти часов. Извлеките питательную среду из планшета, сэкономив 10 миллилитров в конической центрифужной пробирке объемом 15 миллилитров. Промойте ячейки 10 миллилитрами синуса и удалите оставшуюся синусоиду с помощью вакуумной аспирации.

Затем добавьте пять миллилитров 0,25% трипсина и инкубируйте при комнатной температуре до тех пор, пока клетки не оторвутся от пластины. Соберите клетки и переложите суспензию в 10 миллилитров зарезервированной среды. Гранулируйте клетки центрифугированием, отсасывайте все, кроме 0,5 миллилитров среды.

Теперь в ресуспензии тщательно подвешиваем клетки с помощью патрубка для осмотического набухания клеток, добавляем три капли 75 миллимолярного хлорида калия, нагретого до 37 градусов Цельсия, и смешиваем клеточную суспензию с пастом пипеткой. Затем вводят дополнительно 0,5 миллилитра гипотонического раствора. Теперь доведите общий объем гипотонического раствора до пяти миллилитров и перемешайте с помощью пипетирования.

Инкубируйте клеточную суспензию при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20–45 минут в зависимости от типа клеток. Инкубируйте трубки под наклоном, чтобы клетки оставались во взвешенном состоянии. Затем центрифугируйте при 400-кратном перегрузке в течение 10 минут.

Отасуньте все, кроме 0,5 миллиметра надосадочной жидкости, и с помощью прошедшей пипетки для осторожного восстановления клеточной подвешивания клеточной палитры. Осмотически набухшие клетки на этом этапе будут хрупкими, поэтому следует соблюдать осторожность, чтобы не нарушить цитоплазматические мембраны. Далее добавьте три капли автомобильного шума, фиксирующие и аккуратно перемешайте.

После введения дополнительных 0,5 миллилитров фиксатора доведите объем фиксатора до пяти миллилитров и пипеткой доведите до однородной клеточной суспензии. Эти неподвижные элементы могут храниться в темноте при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение нескольких месяцев. Соберите неподвижные клетки центрифугированием, аспирируйте фиксатор и повторно суспендируйте гранулу в 10 объемах фиксатора, держа в микроскопе мокрого льда.

Скользите под углом примерно 45 градусов. Добавляйте клеточную суспензию по каплям, чтобы распределить клеточную суспензию. Залейте горку фиксатором и слейте излишки.

Затем положите горку на бумажные полотенца для сушки на воздухе. Оцените образцы на наличие митотических спредов с помощью инвертированного микроскопа. Добавьте два микролитра 10 микрограмм на миллилитр РНК A в двух XSSC к каждому предметному стеклу и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

Выполните три трехминутных промывки двух XSSC pH 7,0 при комнатной температуре. Затем обезвожьте образцы с помощью этанола при комнатной температуре в течение трех минут. Каждый воздух высушивает образцы при комнатной температуре в охлажденной микрофуговой пробирке.

Добавьте четыре микрограмма нуклеотида, меченного субстратом ДНК, 10 X буфера трансляции NIC, смесь DNTP и фермент трансляции NIC. Инкубируйте реакцию при 16 градусах Цельсия в течение ночи при нагревании при 70 градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы остановить реакцию. Затем охладите на льду в течение пяти минут.

Теперь для осаждения этанола в ДНК добавляем 48 микролитров трехмолярного ацетата натрия, 160 микролитров 0,25 микрограмма на микролитр пойманного 1D NA и 1,2 миллилитра 100% этанола. Храните образец при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы в течение ночи осадить ДНК центрифугированием и промыть гранулу с 70% этанолом, ресуспендировать высушенный на воздухе зонд ДНК в 40 микролитрах двойной дистиллированной воды для конечной концентрации 100 нанограммов на микролитр меченой обратной ДНК для одновременной гибридизации обратного SEP. Подготовьте две отдельные кроватки, 1D NA с коктейлями из зонда, как описано в сопроводительной рукописи.

Денатурируйте зонд коктейлями при температуре 75 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут до 1D NA для повторяющихся последовательностей. Теперь объедините задний щуп с S-зондом в соотношении три к двум для 25 микролитров на образец.

Проведите пальцем по экрану, чтобы денатурировать образцы. Погрузите предметные стекла в 70%-ную форму амида два XSSC при температуре 72 градуса Цельсия и выдержите в течение трех минут. Немедленно обезвожьте образцы с помощью этанола при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех минут.

Каждый воздух высушивает образцы при комнатной температуре примерно за 10 минут до завершения подготовки зонда. Уравновесьте горки на грелке для горок при температуре 45 градусов Цельсия. Затем добавьте 25 микролитров задней S-образной смеси.

К каждому предметному стеклу аккуратно установите крышку и запечатайте по всем краям резиновым цементом для этапа гибридизации. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия во влажной камере. Проведите три промывки после гибридизации по три минуты каждая при 50%-ной IDE двух XSSC pH 7,0 при температуре от 38 до 40 градусов Цельсия.

Оптимальная температура моек зависит от зонда. Если наблюдается высокий фон гибридизации, то увеличьте температуру смывки. И наоборот, если сигнал щупа слабый и фона нет, то уменьшите температуру смывки.

Проведите одну стирку в PN-буфере при комнатной температуре в течение трех минут. Для обнаружения BRDU добавьте 200 микролитров буфера блокировки PNM на каждый слайд. Выдержать 10 минут при комнатной температуре в темноте, слейте воду с горок на бумажное полотенце.

Затем добавьте 100 микролитров 50 микрограммов на миллилитр конъюгированного антитела против B-R-D-U-F-E и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Выполните три трехминутных промывки в PN-буфере при комнатной температуре. Удалите лишний буфер PN с каждого слайда.

Затем добавьте 20 микролитров монтажного раствора Antifa. Накройте слайд бумажным полотенцем и нажмите на защитный лист, чтобы удалить пузырьки воздуха и излишки монтажного раствора. Делайте снимки с помощью флуоресцентного микроскопа, прикрепленного к ПЗС-камере.

Используя объектив 100 x и автоматическое колесо фильтров и программное обеспечение для зрения Cyto, Capture BRDU с помощью фильтра Fitzy и хромосомы, окрашивает обратно, а центромеры зондов с помощью бокового тройного или техасского красного фильтра. Также используйте фильтр для окрашивания ядер. Идентификация отдельных хромосом, представляющих интерес, с помощью задних ВП или хромосомных зондов краски в программном обеспечении cyto vision.

Вырежьте каждую интересующую хромосому из метафазного разброса целиком. Скопируйте и вставьте изображения хромосом DPI и FITZY в новое окно. Выберите значок графика в меню инструментов, который позволяет создать график, представляющий площадь и интенсивность окрашивания Фитца и Даппи вдоль каждой отдельной хромосомы.

Это делается путем проведения линии по всей длине хромосомы от короткого плеча к длинному плечу. В меню инструментов выберите значок данных и сгенерируйте таблицу с отображением рассчитанной площади и интенсивности для ZI и dpi. Далее выберите сигналы ZI и DPI для интересующих хромосом.

Затем нажмите кнопки интенсивности и площади на значке стола. Программное обеспечение генерирует числовое измерение пикселей на квадратный дюйм для каждого сигнала. Затем средняя интенсивность пикселей каждой хромосомы умножается на площадь, занимаемую этими пикселями.

Чтобы получить общее количество пикселей для визуализации новейших реплицирующихся участков хромосом, оцените бандитский паттерн включения BRDU для активно реплицирующихся участков хромосом. Затем рассчитайте различия во времени репликации между парами хромосом на основе различий в структуре полос BRDU. Хромосомы в клетках млекопитающих реплицируются в соответствии с временной программой, при этом ранняя и поздняя репликация происходит в начале и конце S-фазы соответственно.

Типичная саза в клетках млекопитающих длится от восьми до 10 часов, а G 2 обычно составляет от двух до пяти часов. В этой экспериментальной системе BRDU добавляется на все более длительные периоды времени, чтобы пометить последние участки хромосом, которые реплицируют эти клетки, содержат делецию гена человека в виде гена R six, расположенного на шести Q 16.1. После пятичасовой обработки BRDU митотические клетки были собраны и обработаны для включения BRDU и флуоресцентной гибридизации C-2 с использованием зонда краски с шестью хромосомами, две шестерки хромосом отображают три флуоресцентные метки.

Значительная разница в характере полос BRDU согласуется с задержкой времени репликации более чем на два часа для одной из шестерок хромосомы. Программное обеспечение Cyto Vision отображает профили интенсивности разностного сигнала для DPI и BRDU на двух шестерках хромосом, что указывает на асинхронную репликацию. Кроме того, существует значительная разница в общем объеме включения BRDU по сравнению с аналогичным анализом окрашивания DPI.

Включение заднего зонда, содержащего человека в качестве гена AR six, выделяет одну хромосому 6, содержащую делецию на ее длинном плече в этой клетке. Интересно, что здесь наблюдается более интенсивное включение BRDU и более протяженная полосатая структура включения BRDU, чем на шестой хромосоме без ED. Когда митотические спреды из семи различных клеток были обработаны для количественной оценки разницы во времени репликации между шестерками хромосом.

Уровни BRDU показывают более чем двукратную разницу между общими значениями пикселей для удаленных и не-ED хромосомных шестерок. После освоения этой техники ее можно правильно выполнить за три дня. Мы надеемся, что теперь у вас есть хорошее понимание того, как измерить репликацию, время появления гомологичных хромосом, находящихся в одной и той же клетке, и однозначно идентифицировать хромосомные перестройки, которые коррелируют с изменениями в репликации.

Синхронизация целых хромосом.