Хромосома Репликация времени в сочетании с Флуоресцентные

Данный экспериментальный подход сочетает включение BRDU с флуоресцентной гибридизацией in situ для количественного анализа времени репликации хромосом млекопитающих. Сначала включите BRDU в живые клетки и выделите хромосомы в метафазе.

Затем проведите FISH-анализ ДНК в сочетании с последовательным окрашиванием антителами к BrdU для идентификации отдельных реплицирующих хромосом. Далее с помощью фотомикроскопии получите изображения FISH-сигналов и включения BrdU в отдельных митотических фигурах. Используя программное обеспечение CytoVision, рассчитайте площадь и интенсивность пикселей, соответствующих сигналам BrdU или DAPI на каждой изолированной хромосоме.

Результаты позволяют количественно оценить и сравнить включение BrDU в отдельные перестроенные хромосомы и их гомологи. Поскольку описанный здесь метод основан на анализе отдельных клеток, он позволяет выявлять изменения в репликации и тайминге хромосомных перестроек, которые присутствуют лишь в части клеток популяции, в отличие от недавно разработанных высокопроизводительных протоколов на основе микрочипов и секвенирования ДНК. Данный метод обеспечивает возможность прямого сравнения гомологичных хромосом, находящихся в одной и той же клетке.

Данный метод также позволяет однозначно идентифицировать перестройки хромосом, влияющие на репликацию хромосом. Демонстрацию процедуры с целыми хромосомами проведет Лесли Смит, научный сотрудник моей лаборатории. Рассейте клетки в чашке для культивирования тканей диаметром 150 мм до достижения примерно 70% конфлюэнтности и поместите в инкубатор для клеток на 24 часа при соответствующих условиях.

Этапы перед сбором образцов. Добавьте свежую полную среду, содержащую 10 µg/mL BrdU. Продолжительность культивирования клеток в среде с BrdU зависит от типа клеток и вида организма.

Обычно фаза G2 длится от двух до пяти часов. Удалите культуральную среду из планшета, сохранив 10 миллилитров в конической центрифужной пробирке объемом 15 миллилитров. Промойте клетки 10 миллилитрами sine и удалите оставшийся sine с помощью вакуумного аспиратора.

Затем добавьте 5 мл 0,25%трипсина и инкубируйте при комнатной температуре до тех пор, пока клетки не открепятся от планшета. Соберите клетки и перенесите суспензию в 10 мл зарезервированной среды. Осадите клетки центрифугированием, после чего аспирируйте всю среду, кроме 0,5 мл.

Теперь тщательно ресуспендируйте клетки с помощью пастеровской пипетки. Чтобы вызвать осмотическое набухание клеток, добавьте три капли 75 мМ раствора хлорида калия, подогретого до 37 °C, и перемешайте клеточную суспензию пастеровской пипеткой. Затем добавьте еще 0,5 мл гипотонического раствора. Доведите общий объем гипотонического раствора до 5 мл и перемешайте путем пипетирования.

Инкубируйте клеточную суспензию при 37 °C от 20 до 45 минут в зависимости от типа клеток. Инкубируйте пробирки под наклоном, чтобы поддерживать клетки во взвешенном состоянии. Затем центрифугируйте при 400 ×g в течение 10 минут.

Отосфейте весь супернатант, оставив 0,5 мм, и с помощью пастеровской пипетки осторожно ресуспендируйте клеточный осадок. Осмотически набухшие клетки на данном этапе будут хрупкими, поэтому следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить цитоплазматические мембраны. Затем добавьте три капли карнойго фиксатора и осторожно перемешайте.

После добавления еще 0,5 миллилитра фиксатора доведите объем фиксатора до пяти миллилитров и доведите до гомогенной суспензии клеток с помощью пипетирования. Эти фиксированные клетки можно хранить в темноте при температуре минус 20 °C в течение нескольких месяцев. Соберите фиксированные клетки путем центрифугирования, аспирируйте фиксатор и ресуспендируйте осадок в 10 объемах фиксатора, используя охлажденный микроскоп на льду.

Наклоните предметное стекло под углом примерно 45 градусов. Добавляйте клеточную суспензию по каплям, чтобы распределить её по поверхности. Залейте стекло фиксатором, затем слейте излишки.

Затем положите предметное стекло на бумажные полотенца для высыхания на воздухе. Оцените образцы на наличие митотических метафазных пластинок с помощью инвертированного микроскопа. Добавьте по 2 µL РНКазы А в концентрации 10 µg/mL в 2X SSC на каждое стекло и инкубируйте при 37 °C в течение одного часа.

Промойте образцы трижды в 2 XSSC (pH 7.0) по три минуты при комнатной температуре. Затем проведите обезвоживание образцов через серию этанола при комнатной температуре по три минуты на каждый этап. Высушите образцы на воздухе при комнатной температуре в охлажденной микроцентрифужной пробирке.

Добавьте 4 µg меченого нуклеотида ДНК-субстрата, 10 X буфер для трансляции NIC, смесь dNTP и фермент для трансляции NIC. Инкубируйте реакционную смесь при 16 °C в течение ночи, затем нагрейте при 70 °C в течение 10 минут для остановки реакции. После этого выдержите на льду в течение пяти минут.

Теперь для осаждения ДНК этанолом добавьте 48 µL 3 M ацетата натрия, 160 µL cot-1 DNA в концентрации 0,25 µg/µL и 1,2 mL 100% этанола. Храните образец при температуре -80 °C от 10 минут до ночи. Осадите ДНК путем центрифугирования и промойте осадок 70% этанолом. Ресуспендируйте высушенный на воздухе ДНК-зонд в 40 µL двукратно дистиллированной воды до конечной концентрации меченой cot-1 DNA 100 ng/µL для одновременной гибридизации Back-SEP. Приготовьте два отдельных коктейля зондов, содержащих cot-1 DNA, как подробно описано в прилагаемой рукописи.

Денатурируйте коктейли зондов при 75 °C в течение 10 минут. Затем инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут для отжига cot 1D NA к повторяющимся последовательностям. Теперь смешайте обратный зонд с S-зондом в соотношении три к двум, используя по 25 µL на образец.

Перейдите к следующему этапу для денатурации образцов. Погрузите предметные стекла в раствор 70% формамида и 2X SSC при 72 °C и инкубируйте в течение трех минут. Сразу же проведите дегидратацию образцов через серию этанола при 4 °C в течение трех минут.

Высушите каждый образец на воздухе при комнатной температуре в течение примерно 10 минут перед завершением подготовки зонда. Доведите слайды до равновесного состояния на подогревателе для слайдов при температуре 45 °C. Затем добавьте 25 µL смеси зондов back S.

На каждый предметное стекло осторожно поместите покровное стекло и герметично заклейте все края резином для проведения этапа гибридизации. Инкубируйте образцы в течение ночи при 37 °C в увлажненной камере. Выполните три послегибридизационные промывки по три минуты каждая в 50% IDE 2X SSC pH 7.0 при температуре от 38 до 40 °C.

Оптимальная температура промывки зависит от используемого зонда. При высоком уровне фоновой гибридизации следует увеличить температуру промывки. И наоборот, если сигнал зонда слабый и фон отсутствует, следует снизить температуру промывки.

Проведите одну промывку в буфере PN при комнатной температуре в течение трех минут. Для детекции BRDU добавьте по 200 microliters блокирующего буфера PNM на каждый предметное стекло. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте, затем удалите излишки жидкости с предметных стекол с помощью бумажного полотенца.

Затем добавьте 100 µL антител, конъюгированных с B-R-D-U-F-E, в концентрации 50 µg/mL, и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C. Трижды промойте препараты в PN-буфере по 3 минуты при комнатной температуре. Удалите излишки PN-буфера с каждого предметного стекла.

Затем добавьте 20 µL фиксирующего раствора dappy Antifa. Накройте предметное стекло бумажным полотенцем и нажмите на покровное стекло, чтобы вытеснить пузырьки воздуха и излишки фиксирующего раствора. Снимите изображения с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного ПЗС-камерой.

Используя объектив 100x, автоматическое колесо фильтров и программное обеспечение CytoVision, зарегистрируйте сигнал BrdU с помощью фильтра FITC, а также хромосомные краски и центромерные зонды с помощью фильтра Rhodamine или Texas Red. Также используйте фильтр DAPI для окрашивания ядер. С помощью программного обеспечения CytoVision идентифицируйте интересующие вас отдельные хромосомы, используя специфические зонды к центромерам (CEP) или хромосомные краски.

Вырежьте каждую интересующую хромосому из метафазного препарата целиком. Скопируйте и вставьте изображения хромосом с окрашиванием DPI и FITZY в новое окно. Выберите значок графика в меню инструментов, который позволяет построить график, отображающий площадь и интенсивность окрашивания FITZ и dappy вдоль каждой отдельной хромосомы.

Это выполняется путем проведения линии вдоль всей хромосомы от короткого плеча к длинному. В меню инструментов выберите значок данных и сформируйте таблицу с рассчитанными значениями площади и интенсивности для ZI и dpi. Затем выберите сигналы ZI и DPI для интересующих хромосом.

Затем нажмите кнопки интенсивности и площади на иконке таблицы. Программное обеспечение вычисляет численное значение количества пикселей на квадратный дюйм для каждого сигнала. Далее средняя интенсивность пикселей каждой хромосомы умножается на площадь, занимаемую этими пикселями.

Для получения общего количества пикселей при визуализации последних реплицирующих участков хромосом оцените паттерн полос включения BRDU в активно реплицирующих участках хромосом. Затем рассчитайте различия во времени репликации между парами хромосом на основе различий в паттерне полос BRDU. Хромосомы в клетках млекопитающих реплицируются согласно временной программе, при которой ранняя и поздняя репликация происходят в начале и в конце S-фазы соответственно.

Типичная S-фаза в клетках млекопитающих длится от восьми до 10 часов, а G2-фаза обычно занимает от двух до пяти часов. В данной экспериментальной системе BrdU добавляют на возрастающий промежуток времени, чтобы пометить последние участки хромосом, которые реплицируются; эти клетки содержат делецию человеческого гена ASXL1, расположенного в локусе 6q16.1. После пятичасовой обработки BrdU митотические клетки собирали и подвергали анализу на включение BrdU и флуоресцентную гибридизацию in situ с использованием зонда для «окрашивания» (painting) хромосомы 6; две хромосомы 6 демонстрируют три флуоресцентные метки.

Значительное различие в характере полос BRDU согласуется с задержкой времени репликации более чем на два часа для одной из шестых хромосом. Программное обеспечение Cyto vision отображает различные профили интенсивности сигналов DPI и BRDU для двух шестых хромосом, что указывает на асинхронную репликацию. Кроме того, наблюдается значительная разница в общем количестве включенного BRDU по сравнению с аналогичным анализом окрашивания DPI.

Включение обратного зонда, содержащего человеческий ген AR six, позволяет выделить одну хромосому 6 с делецией в длинном плече в данной клетке. Примечательно, что в этой хромосоме наблюдается более интенсивное включение BrdU и более протяженный паттерн полос включения BrdU, чем в хромосоме 6 без делеции. Для количественного определения разницы во времени репликации между двумя хромосомами 6 были обработаны митотические препараты семи разных клеток.

Уровни BrDU демонстрируют более чем двукратную разницу в суммарных значениях пикселей между делетированной и не-ED шестой хромосомой. После освоения данной методики её правильное выполнение занимает три дня. Надеемся, что теперь вы хорошо понимаете, как измерять репликацию и тайминг гомологичных хромосом, находящихся в одной клетке, а также однозначно идентифицировать хромосомные перестройки, коррелирующие с изменениями репликации.

Тайминг репликации целых хромосом.