Анализ изображений нейрона к Glia Взаимодействие в Микрофлюидных Платформа культуры (MCP) на основе нейронных аксонов и глии Co-культуре системы

В данном протоколе описывается создание новой платформы для совместного культивирования нейронных аксонов и астроглии, предназначенной для анализа взаимодействий между нейронами и глией с помощью визуализации высокого разрешения. Сначала следует собрать микрофлюидную камеру для культивирования, подготовить нейронные культуры и стимулировать рост аксонов нейронов в противоположную часть MCP. Затем добавьте культивируемые астроциты для создания компартментализированной системы совместного культивирования; полученные результаты, включая таймлапс-визуализацию с помощью конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии, помогут изучить взаимодействия между аксонами, астроглией и нейронными аксонами.

Идея этого метода возникла у нас при попытке разделить влияние нейрональных отростков и нейрональной секреции на регуляцию GT. Обычно люди, только начинающие осваивать данный метод, сталкиваются с трудностями при индукции роста аксонов в другие части клеточного компартмента. Для этого требуется высокая плотность жизнеспособных нейронов, высеянных на нейрональной стороне, при этом нейроны должны быть расположены близко к центральным каналам.

Открытые камеры MCP предназначены для раздельного культивирования различных типов клеток; для высева нейронов и астроцитов в кокультуру необходимо использование полиуретанового и ламинин-покрытия. Сначала нанесите раствор полиуретана в концентрации 1 mg/mL на стерильные планшеты с стеклянным дном и инкубируйте при 37 °C в течение ночи. Промойте покрытые планшеты с стеклянным дном трижды дважды дистиллированной водой, после чего поместите их в стерильный вытяжной шкаф для высушивания.

Затем покройте чашку ламинином в концентрации 1 mg/mL и высушите под УФ-светом в течение одного часа. Сборку MCP на чашке с стеклянным дном следует подготовить непосредственно перед использованием. Расположите микрофлюидную культуральную платформу центральными соединительными каналами на нижней стороне и обеспечьте герметичное прилегание к покрытому стеклу.

Нижние чашки. Добавьте стандартные среды для культивирования нейронов или астроцитов по обе стороны собранного MCP. Инкубируйте камеру в течение двух-четырех часов при 37 °C и убедитесь в отсутствии утечек между MCP и стеклом.

Нижняя часть чашки. Культуры кортикальных нейронов подготавливают из свежевыделенного материала из головного мозга эмбрионов мыши на 14–16 день развития. После диссекции головного мозга мыши удаляют мозговые оболочки с поверхности коры под диссекционным микроскопом.

С помощью лезвия бритвы измельчите ткань на небольшие фрагменты и после центрифугирования перенесите измельченные фрагменты ткани в пробирку. Удалите среду над осадком, добавьте 0,05% Trypsin и выдержите в водяной бане при 37 °C в течение 10 минут. Диссоциируйте клетки путем осторожного тритурации с помощью пастеровской пипетки с оплавленным концом.

Пропустите образец через сито с размером пор 70 мкм, чтобы получить прозрачную суспензию нейрональных клеток, используя среду для посева нейронов, дополненную 5% FBS. Высейте 150 мкл нейронов в правую часть собранной MCP-пластины.

Высокая плотность нейронов необходима, так как только те нейроны, которые прикрепляются в области удержания клеток, способны проращивать аксоны через центральные каналы на противоположную сторону собранной MCP. На следующий день осторожно аспирируйте среду из области посева клеток в камере и замените среду для посева нейронов на обычную среду для культивирования нейронов.

В среду на стороне астроцитов камеры добавьте глиальный нейротрофический фактор (GDNF) в концентрации 20 nanograms per milliliter. Это создаст химический градиент, который будет способствовать росту аксонов с нейрональной стороны через центральные каналы собранного MCP. Через два дня проверьте наличие аксонов, проросших в центральный канал.

После попадания аксонов в центральный канал они обычно достигают противоположной стороны в течение одного дня. Как правило, аксоны остаются целостными в течение как минимум одной недели после достижения противоположной стороны. После выделения мозга из мышат в возрасте от одного до трех пухлых дней астроциты высевают в 10 сантиметровые чашки, покрытые полиуретаном.

Культивируйте клетки в течение ночи, ежедневно обновляя среду для культуры астроцитов в течение следующих двух дней, а затем один раз в три дня. Спустя семь дней, когда астроциты образуют монослой с 90% конфлюэнтностью, соберите клетки с помощью трипсина. Примерно через пять дней после посева нейронов удалите GDNF. Затем внесите 150 µL ресуспендированных астроцитов в левую часть собранного MCP. Когда аксоны готовы войти или только что вошли в область после повторного посева астроцитов, аксоны, попавшие в левую часть собранного MCP, вступают в прямое взаимодействие с астроцитами либо путем прямого аксонального контакта, либо посредством высвобождения растворимых факторов.

Контролируйте прикрепление астроцитов к зоне удержания клеток. Проведите иммуноокрашивание клеток в компартментной системе совместного культивирования для визуализации специфических белков, например, тех, которые участвуют во взаимодействии между аксонами и астроцитами. Компартментная система совместного культивирования нейронов и астроцитов позволяет избирательно взаимодействовать с астроцитами только нейрональным отросткам, в особенности аксонам.

Здесь мы описываем индуцированную аксонами транскрипционную активацию транспортера глутамата астроглии. В этих исследованиях используются трансгенные мыши, экспрессирующие флуоресцентный репортер EGF под контролем геномного промотора GT1. Высокая плотность нейронов культивируется в области удержания клеток собранного MCPA; при увеличении видно, что аксоны пересекают центральные каналы и выходят с другой стороны, а окрашивание на бета-III-тубулин позволяет визуализировать конус роста аксонов.

Система MCP позволяет осуществлять мониторинг пучков аксонов по мере их роста через центральный канал и выхода с другой стороны. Иммуноокрашивание на GLT-1 позволяет идентифицировать астроциты на глиальной стороне сформированной системы MCP. На изображении показан контакт между аксонами и GLT-1-положительными астроцитами.

Экспрессия репортера EGFP коррелирует с активацией эндогенного промотора GT one, экспрессией белка и функциональной активностью. Оценка активности промотора GT one в отдельных астроцитах в C two демонстрирует значительно повышенную иммунореактивность GLT one в компартментализированной системе кокультуры. Важно отметить, что система MCP позволяет получать изображения в режиме тайм-лапс для мониторинга динамических изменений.

Например, эти данные демонстрируют активацию промотора GT1, индуцированную аксонами, в астроцитах с базовой экспрессией GT1-EGFP и нейронах дикого типа через день после посева астроцитов. Наблюдается минимальная флуоресценция EGFP. Интенсивность EGFP значительно возрастает через 48 часов совместного культивирования, когда аксоны глубоко проникают в слой астроцитов и напрямую взаимодействуют с ними.

Обработка хинином нейрональной стороны собранной MCP индуцировала гибель нейронов. Примечательно, что это также стимулировало ретракцию и дегенерацию аксонов, а также привело к снижению флуоресценции EGFP в аксонах. Эти динамические изменения интенсивности флуоресценции EGFP в аксонах наглядно продемонстрировали, что активность промотора Astroglia GT 1 модулируется взаимодействием с аксонами.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создать систему культивирования ядер с использованием микрофлюидной платформы; после освоения данной методики ее правильное выполнение будет занимать всего несколько дней.