Исследование Checkpoint повреждения ДНК использовании

Общая цель данной процедуры заключается в исследовании контрольной точки повреждения ДНК с использованием экстрактов яиц xip в качестве модельной системы. Сначала подготовьте низкоскоростной экстракт из яиц xip. Затем подготовьте поврежденный хроматин сперматозоидов с помощью таких способов повреждения ДНК, как воздействие MMS и УФ-излучения.

Также подготовьте структуру, имитирующую повреждение ДНК. Используйте AT70 для активации контрольной точки повреждения ДНК в LSE с поврежденным хроматином сперматозоидов или с AT70. В конечном итоге результаты вестерн-блоттинга позволят получить сведения о контрольной точке повреждения ДНК, опосредованной ATR чек-1, в экстракте яиц Xenopus.

Здравствуйте. С вами CH Y с кафедры биологии Университета Северной Каролины в Шарлотт. Сегодня мы покажем вам, как экстракт гноя используется в качестве модельной системы для исследования повреждения сигнального пути tech point.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области динамической нестабильности, например, о том, как активируется контрольная точка повреждения ДНК. Настоящий протокол предназначен для приготовления экстракта ядер Xenopus, реагентов, индуцирующих контрольную точку повреждения ДНК, а также для анализа данной контрольной точки и xap. Эти методы применимы к различным способам повреждения ДНК, включая воздействие 4-NQO и依托泊苷 (etoposide).

Приступим к изучению контрольной точки повреждения ДНК. Чтобы подготовить самок лягушек к кладке икры, подкожно введите 100 единиц PMSG в дорсальные лимфатические мешки. По прошествии минимум двух дней после подготовки индуцируйте кладку икры, подкожно введя каждой подготовленной лягушке 500 единиц человеческого хорионического гонадотропина в дорсальные лимфатические мешки; выдержите инъецированных лягушек от 14 до 20 часов в отдельных ведрах, содержащих два литра модифицированного раствора Рингера Маркса.

Извлеките лягушек из ведер и слейте раствор MMR, оставив около 100 миллилитров. Затем перенесите икру из ведер в стакан объемом 250 миллилитров; удалите желеобразную оболочку яиц, добавляя по 100 миллилитров 2% цистеина (pH 7.8) примерно каждые 30 секунд. Осторожно перемешивайте икру с помощью перевернутой стеклянной пастураловской пипетки диаметром 0,7 сантиметра, затем дважды слейте раствор и замените его свежим цистеином.

Процесс дехорионирования завершится примерно через 5–15 минут. Когда яйца образуют более плотный слой на дне стакана, удалите раствор цистеина и трижды промойте яйца раствором 0,25 XMMR. Осторожно перемешайте яйца стеклянной пипеткой и осмотрите их на наличие вздутых белых нежизнеспособных яиц, которые обычно скапливаются в центре стакана.

Удалите поврежденные яйца с помощью пастуральной пипетки. Затем трижды промойте яйца буфером для лизиса яйца. Удалите все оставшиеся поврежденные яйца, после чего перенесите яйца в фалькон-пробирку объемом 14 мл.

Уплотните яйца путем центрифугирования в течение 55 секунд при 188 $\times$g. Используя лабораторную настольную центрифугу с ротором с качающимися стаканами, удалите избыток буферного раствора над слоем яиц. Теперь на каждый миллилитр уплотненных яиц добавьте 0,5 µL апротинина, лептина или AL в концентрации 10 mg/mL и 0,5 µL цитокина B или cyto B в концентрации 5 mg/mL. Центрифугируйте яйца при 16 500 $\times$g в течение 15 минут при температуре 4 °C. Используя высокоскоростную центрифугу Sarva RC 6 plus с ротором с качающимися стаканами HB 6, после центрифугирования фракционируйте содержимое пробирки на три слоя: липидный экстракт и пигмент желтка (сверху вниз соответственно). Проколите стенку пробирки Falcon в нижней части среднего слоя экстракта иглой 21G.

Осторожно извлеките иглу, так как прокольная игла может быть заблокирована пластиком. В место прокола введите новую иглу калибра 21, прикрепленную к шприцу объемом 1 мл, чтобы собрать экстракт.

Медленно аспирируйте экстракт, избегая образования пузырьков воздуха и загрязнения слоями липидов и желточного пигмента. Перенесите экстракты в охлажденную микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 milliliter. На каждый milliliter экстракта яйца добавьте 10 microliters раствора с концентрацией 10 milligrams per milliliter.

Циклогексимид 1 µL из раствора 10 mg/mL. Пронинин лептин 1 µL из раствора 5 mg/mL, цитокин B 1 µL 1 M DTT и 0,33 µL из раствора 10 mg/mL. Смешайте, аккуратно перевернув пробирку с яичным экстрактом не менее 10 раз. Экстракт необходимо использовать в течение четырех часов, так как качество LSE со временем снижается.

После четырех часов или полного размораживания растворите два синтетических олигонуклеотида в воде до концентрации 2 µg/µL. Добавьте по 100 µL каждого олигонуклеотида в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте в течение пяти минут в термоблоке при температуре 95 °C. Извлеките пробирку со смесью олигонуклеотидов из термоблока, дайте ей остыть до комнатной температуры, затем разлейте по аликвотам по 10 µL для хранения при температуре -20 °C.

Образец AL теперь представляет собой дуплекс A T 70 с конечной концентрацией 2 µg/µL. Подготовьте нормальный хроматин сперматозоидов по методу Tudor и Walter, чтобы получить 0,5 mL хроматина. Добавьте 5,5 µL 9,1 M MMS.

Поместите пробирку с образцом на ротатор при комнатной температуре на 30 минут, используя клиническую центрифугу IE CCL two с ротором с маятниковыми стаканами и адаптерами для пробирок. Центрифугируйте образец при 686 ×g в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалите супернатант и промойте осадок в 0,5 milliliters буфера X, содержащего B-S-A-D-T-T-A proin и лептин.

Повторите этот процесс три раза и ресуспендируйте осадок в 0,5 мл буфера x. Определите концентрацию хроматина сперматозоидов с помощью гемоцитометра.

Затем разбавьте образец до концентрации 100 000 сперматозоидов на микролитр и храните аликвоты по 5 µL при температуре -80 °C. Нанесите необходимое количество нормального хроматина сперматозоидов на поверхность парафильма и поместите образец в УФ-кросслинкер. Установите требуемый параметр энергии и начните повреждение хроматина сперматозоидов с помощью УФ-излучения.

Используйте хроматин спермы, подвергнутый УФ-облучению, немедленно для индукции контрольной точки повреждения ДНК в подготовленном низкоскоростном экстракте. Смешайте 50 µL LSE, 1 µL энергетической смеси и 2 µL поврежденного хроматина спермы. Инкубируйте реакционную смесь при комнатной температуре в течение 90 минут, не забывая встряхивать пробирку каждые 10 минут после первых 30 минут инкубации.

После инкубации нанесите один микролит реакционной смеси на предметное стекло микроскопа и добавьте один микролит раствора ядерного красителя. Накройте образец покровным стеклом и проверьте образование ядер с помощью флуоресцентного микроскопа. Как правило, через 30 минут инкубации образуются округлые ядра, что свидетельствует о начале репликации ДНК.

Также проведите анализ 10 µL реакционной смеси методом иммуноблоттинга с использованием антител anti check one. Смешайте 50 µL LSE, 1 µL energy mixture и 1,6 µL стокового раствора toto mycin в микроцентрифужной пробирке. Затем добавьте 1,25 µL либо T 70 DNA duplex в концентрации 2 µg/µL, либо воду для отрицательного контроля.

Инкубируйте смеси для реакций при комнатной температуре в течение 90 минут, слегка встряхивая пробирки каждые 10 минут. Затем добавьте 10 µL реакционной смеси в 90 µL буфера для образцов для проведения вестерн-блот-анализа белка check one. Поврежденный хроматин сперматозоидов или структуры, имитирующие повреждение ДНК, эффективно активируют контрольную точку повреждения ДНК, опосредованную ATR check one, в системе экстракта яиц xop по сравнению с контролем, индуцированным MMS.

Проверьте фосфорилирование серина 3 44, который является индикатором активации киназы TR. Аналогично, Т 70, представляющий собой структуру, имитирующую повреждение ДНК, также вызывает фосфорилирование. После освоения метода подготовка LSE может быть завершена примерно за один час.

Поскольку качество экстракта снижается примерно через четыре часа, скорость и эффективность выполнения процедур имеют решающее значение. Эти методы могут быть объединены с другими подходами для поиска ответов на критические вопросы о передаче сигналов контрольных точек повреждения ДНК. Например, можно провести иммунодеплецию, чтобы проверить, требуется ли определенный белок-мишень для работы контрольной точки повреждения ДНК.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как изучать контрольную точку повреждения ДНК, используя экстракт дрожжей в качестве модельной системы. Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.