Гиппокампа Микроинъекция инсулина и

Общая цель данной процедуры заключается в измерении метаболизма гиппокампа во время поведенческого тестирования. Это достигается путем хирургической подготовки обученного животного с установкой направляющей канюли для микродиализа. В день тестирования в канюлю вводится микродиализный зонд, после чего подтверждается поток PERFUSE eight.

Затем зонду дают время на установление равновесия, пока животное находится в контрольной камере. В конечном итоге применяются соответствующие аналитические методы, например, реакция с использованием глюкозооксидазы, NADP и NADPH, и флуорометрический анализ. Если измерение уровня глюкозы используется для демонстрации интенсивности метаболизма и/или нейрохимического высвобождения в течение периода тестирования, одним из наиболее сложных аспектов данной методики является необходимость осторожного обращения с трубками для микродиализа, поскольку при отсутствии должной осторожности животные часто перегрызают их или запутывают линии.

Впервые я применил микродиализ гиппокампа во время поведенческого тестирования в период работы над диссертацией; мы хотели проверить, совместимы ли существующие модели подачи глюкозы с известными психологическими данными об улучшении памяти под воздействием глюкозы. Данная методология позволила нам показать, что существующие модели введения глюкозы в мозг на самом деле были совершенно ошибочными.

Согласно стандартным хирургическим процедурам, подготовьте животное, обнажите череп и просверлите отверстия для установки канюли. Введите канюлю по заранее определенным координатам, затем медленно опустите ее до целевой глубины. После правильного позиционирования зафиксируйте канюлю с помощью стоматологического цемента.

При необходимости используйте стерильный хирургический шов для закрытия раны. В завершение используйте стилет для поддержания проходимости канюли. Затем подготовьте PERFUSE eight для проведения микродиализа.

Следует отметить, что для получения оптимальных результатов необходим точный состав жидкости. В день проведения тестирования следует добавить бычий сывороточный альбумин BSA и полностью растворить его. После приготовления раствор PERFUSE eight необходимо профильтровать через фильтр с порами 0.2 micron.

Затем, используя аликвоту приготовленного A ECF, подготовьте препарат для введения в мозг (если таковой предусмотрен). В данном случае для доставки в гиппокамп готовится инсулин. Новый микродиализный зонд и линию следует подготовить за день до проведения тестирования.

Создайте две отдельные линии для притока и оттока. Используйте трубки PE 50 для соединения двух отрезков трубок FEP длиной один метр каждый, обеспечив минимальный мертвый объем между линиями. Трубки следует обрезать, как показано на рисунке, чтобы создать скошенные края для облегчения вставки в соединители PE 50.

Подсоедините входную трубку к шприцу Hamilton объемом 1 мл, заполненному стерильной фильтрованной деионизированной водой, и прикрепите зонд к другому концу, чтобы животное могло свободно передвигаться во время проведения измерений. Подключите входную и выходную линии к двухканальному поворотному соединителю (свивелю). Затем подсоедините выходную трубку к насосу и запустите его со скоростью 1.5 µL в минуту, пока не увидите, что деионизированная вода выходит из выходной трубки зонда.

Выключите насос и соедините другую линию между выпускной трубкой и пробиркой для сбора образцов. Пропустите через трубку пять миллилитров жидкости, после чего поместите зонд на ночь в флакон со стерильной деионизированной водой, следя за тем, чтобы кончик зонда всегда оставался влажным. За 24 часа до начала тестирования подготовьте подопытный объект, извлекая имитационный стилет и вводя микродиализный зонд, предназначенный только для этой цели.

В течение следующих 10 минут замените имитационный стимул и верните крысу в клетку. В качестве альтернативы на этом этапе можно использовать новый зонд и оставить его на месте до момента проведения измерений. На следующий день.

В день проведения микродиализа наполните шприц Hamilton и scintillation vial фильтрованным A ECF и дайте насосу стабилизироваться в течение одного часа. При необходимости наполните второй шприц Hamilton подготовленным препаратом и установите его в шприцевой насос. Залогом успеха в данной процедуре является сохранение спокойствия и максимально бережное обращение с животным.

Поэтому сохраняйте спокойствие, двигайтесь медленно и точно и, прежде всего, практикуйтесь. После завершения уравновешивания извлеките тренировочный стилет и осторожно введите уравновешенный микродиализный зонд в мозг крысы через канюлю. Поместите крысу в прозрачный пластиковый бокс, в котором находится привычный ей подстилочный материал.

Обязательно сбалансируйте трубки. Прикрепите к трубкам за пределами клетки микроцентрифужную пробирку объемом 1.6 milliliter, наполненную водой, таким образом, чтобы под действием силы тяжести линии микродиализа оставались без перегибов, но не были натянуты. Дайте зонду и крысе стабилизироваться в течение двух часов.

В начале этого периода убедитесь, что поток Perfuse eight не заблокирован. Для этого соберите вытекающую жидкость PERFUSE eight за определенный промежуток времени и взвесьте образец, чтобы подтвердить, что из системы выходит ожидаемый объем, прежде чем приступать к сбору образцов. Убедитесь, что корреляция между диализом образца и его сбором рассчитана точно.

Здесь объем между зондом и точкой сбора составляет 30 µL при скорости потока 1,5 µL/мин. Задержка с момента выхода образца из мозга до его сбора составляет 20 минут. После периода уравновешивания соберите не менее трех образцов, пока крыса находится в состоянии покоя в домашней камере.

Для установления стабильного базового уровня измерений перед поведенческим тестированием тщательно спланируйте время доставки препарата в мозг. В данной установке, где объем между наконечником шприца и зондом, введенным в мозг животного, составляет 30 µL, мы заменяем шприц с раствором на шприц с соответствующим лечебным раствором за 20 минут до начала. Это необходимо, чтобы препарат достиг гиппокампа к моменту смены шприцев.

Просто отсоедините линию притока от шприца с контрольным перфузатом и быстро подключите ее к шприцу с терапевтическим перфузатом. Эта операция должна занять не более пяти секунд, чтобы избежать прерывания потока PERFUSE eight. Будьте осторожны, чтобы не допустить попадания пузырьков воздуха, которые могут снизить эффективность в соответствующий период времени.

После проведения терапии осторожно перенесите крысу в выбранную установку для поведенческого тестирования. В данном случае спонтанное чередование измеряют в Т-образном или крестообразном лабиринте. Позвольте животному свободно исследовать лабиринт в течение 20 минут.

Зафиксируйте последовательность и время работы рычага Aries, используя видеозапись или записывая данные вручную для сбора образцов. В течение этого периода переместите выпускную трубку в новую пробирку для сбора. Каждые пять минут придерживайте трубку так, чтобы она перемещалась свободно.

Оно не должно препятствовать движению крысы или перемещаться перед животным; оставайтесь неподвижными, чтобы ваши движения не влияли на поведение крысы. После завершения тестирования осторожно извлеките крысу из лабиринта и верните ее в контрольную камеру. Продолжайте сбор образцов при микродиализе, получив не менее четырех образцов, чтобы охватить период восстановления после выполнения задания.

После сбора необходимых образцов осторожно извлеките зонд из головы животного и поместите его в пробирку для хранения. Верните животное в домашнюю клетку и внимательно наблюдайте за любыми изменениями в состоянии здоровья или поведении после эксперимента. В завершение промойте трубку, используя шприц с раствором catho, чтобы предотвратить рост микробов.

На данном примере показано снижение уровня глюкозы в межклеточной жидкости (ECF) гиппокампа, связанное с выполнением задачи. Серым цветом обозначено время пребывания животного в лабиринте. Фиолетовая линия отображает уровень глюкозы в гиппокампе животных, которые не проходили тест в лабиринте, а красная линия — животных, выполнявших задачу на спонтанное чередование поворотов передних конечностей.

Оранжевая линия отображает результаты измерений у животных, выполнявших облегченную версию данной задачи с тремя плечами. Здесь представлены изменения уровней глюкозы и лактата в гиппокампе после введения инсулина. Обратите внимание, что эти изменения наблюдаются в отсутствие поведенческого тестирования и, следовательно, отражают воздействие одного лишь инсулина в исходных условиях.

При выполнении данной процедуры крайне важно сохранять спокойствие. Крысы могут воспринимать стресс экспериментатора, что приведет к их возбуждению; это может как существенно осложнить процесс, так и исказить результаты вашего исследования. Сочетание данных методов позволило проводить точные нейрохимические исследования поведенческих процессов.

Схожие методы в настоящее время применяются и у людей. Например, пациентам с эпилепсией, которым имплантируют электроды для локализации очага судорог, могут быть также имплантированы канюли для микродиализа с целью проведения метаболических измерений.